陳茹芬 楊清緒 李旭艷

1 廣東惠州中心醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科（516001）

2 廣東惠州中心醫(yī)院病理科（516001）

3 廣東惠州中心醫(yī)院檢驗(yàn)中心（516001）

生存素（survivin）是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白（IAP）家族中新的一員,其抗凋亡作用的機(jī)制可通過caspase途徑和非caspase途徑實(shí)現(xiàn)[1]，是目前人類IAPs家族中研究最多的一個(gè)基因。研究已證實(shí)多種常見腫瘤如胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、肝癌等均存在survivin異常表達(dá)[2]，但在正常成人組織不表達(dá)或呈低表達(dá)。本文采用RT-PCR法檢測(cè)大腸癌及癌旁組織中survivin mRNA表達(dá)情況，并探討了生存素的表達(dá)與大腸癌臨床病理的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床病例

選取惠州中心醫(yī)院2008年8月至2009年11月經(jīng)病理組織學(xué)診斷為大腸腺癌50例（男35例，女15例），平均56.8歲（36～70歲）；術(shù)后病理證實(shí)乳頭狀腺癌為15例，管狀腺癌為13例，黏液腺癌為15例，印戒細(xì)胞癌為7例；按分化程度高分化腺癌25例，中分化腺癌15例，低分化腺癌10例；按Dukes'臨床分期，A期10例，B期22例，C期18例。在手術(shù)中采集癌旁組織標(biāo)本（距腫瘤邊緣5cm處）30例正常大腸組織作為對(duì)照。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 主要試劑與儀器

兔抗人survivin多克隆抗體、DAB顯色劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，SP試劑盒購(gòu)自武漢博士德，Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，survivin基因引物由北京奧克公司合成。紫外凝膠顯像儀（美國(guó)），Nikon Eclipse E1000采圖攝像系統(tǒng)（日本）。

1.2.2 RT-PCR法檢測(cè)生存素mRNA的表達(dá)

①取液氮保存的組織50～100mg，按Trizol說明書提取組織中的總RNA。②cDNA合成 取待測(cè)RNA 2μg，100ng/μL隨機(jī)引物1μL，加水至20μL，70℃變性5min，冷卻后再加入Moloney小鼠白血病病毒（M-MLV）逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液8μL，0.1MDTT 4μL，10mmol/L dNTPs 2μL，RNA酶抑制劑（Rnasin）20U，加水至終體積40μL，37℃加熱1h，冷卻后即完成cDNA的合成。③PCR反應(yīng)：采用50μL的反應(yīng)體系，其中包括：10×緩沖液，MgCl 21.5～2mmol/L引物各12.5pmol/L，Tag聚合酶1.5U，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物β2微球蛋白為3μL，生存素為5μL。所用β2微球蛋白引物序列：上游引物為5-CTCGC GCTAC TCTCT CTTTC-3’；下游引物為5’-CATGT CTCGT TCCCA CTTAA C-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為330bp。所用生存素的引物序列：上游引物為5’-TTGAA TCGCG GGACC CGTTG G-3’；下游引物為5’-CAGAG GCCTC AATCC AT-GGC A-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為528bp。擴(kuò)增條件：β2MG 94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸7min；生存素為94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性45s，61℃退火45s，72℃延伸1min，共擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸7min。所有擴(kuò)增均在GeneAmp System 9600熱循環(huán)儀上進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物在含0.5mg/L溴乙錠、20g/L的瓊脂糖凝膠上電泳分離，在凝膠成像儀（VILBER LOURMAT）上對(duì)產(chǎn)物掃描，應(yīng)用分析軟件作相對(duì)半定量分析，在同一塊凝膠上以生存素mRNA表達(dá)的吸光度值除以β2微球蛋白mRNA表達(dá)的吸光度值表示，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)以大于癌旁正常組織產(chǎn)物表達(dá)的平均相對(duì)值界定。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織中survivin蛋白表達(dá)

組織經(jīng)10%中性甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min，熱抗原修復(fù)20min，正常馬血清封閉，室溫孵育10min。1∶200 survivin一抗4℃過夜，PBS洗片5min×3次，滴加生物素標(biāo)記二抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水、透明、封片。用已知陽(yáng)性肺癌切片為陽(yáng)性對(duì)照切片，常規(guī)抗體稀釋液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS12..0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用，t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著意義。

2 結(jié) 果

2.1 survivin在大腸癌和癌旁組織的表達(dá)

60例大腸癌組織survivin mRNA陽(yáng)性表達(dá)40例（66.6%）明顯高于癌旁組織2例（6.6%）（χ2=6.85，P＜0.01）。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

60例大腸癌組織survivin mRNA陽(yáng)性表達(dá)40例（66.6%）明顯高于癌旁組織2例（6.6%）（χ2=6.85，P＜0.01）；且survivin表達(dá)與病理分級(jí)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（χ2=4.25，χ2=4.85，P＜0.01；r=5.12，r=5.32，P＜0.05）；而survivin的表達(dá)與性別、年齡、癌組織的病理分型沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 survivin在大腸癌組織中表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

3 討 論

生存素（survivin）是1997年耶魯大學(xué)的Aitieric等[3]在人類基因組庫(kù)中首先篩選分離出來的IAP（凋亡抑制蛋白）家族的一個(gè)新成員。在胚胎和胸腺組織中豐富表達(dá)，在人類大多數(shù)腫瘤亦存在高表達(dá)。大多數(shù)研究均認(rèn)為，生存素除了在胚胎發(fā)育過程中和絕大多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)外，在正常組織中不表達(dá)[4]。本研究采用較為敏感的RT-PCR方法檢測(cè)大腸癌及癌旁正常組織中生存素mRNA的表達(dá)，結(jié)果大腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率（66.6%）明顯高于癌旁正常組織（6.6%），這與Sarela等[5]的研究結(jié)果一致，表明生存素是一個(gè)較為特異的腫瘤標(biāo)志物。分析survivin表達(dá)與大腸癌的主要參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)survivin的表達(dá)與性別、年齡、病理類型等無明顯關(guān)系，與病理分級(jí)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Survivin在病理分級(jí)低的組中及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性表達(dá)率均高于病理分級(jí)高的組及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示survivin的表達(dá)可能會(huì)影響大腸癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，使其更容易浸潤(rùn)周圍組織，發(fā)生局部轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性行為，也可能是預(yù)后不良的指征。生存素mRNA的表達(dá)與腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)，這已在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、食管癌、肝癌中得到證實(shí)[6,7]。在大腸癌的研究中，Sarela等[5]的研究表明，在Ⅱ期大腸癌中生存素mRNA陰性表達(dá)組患者的5年生存率（94.4%）遠(yuǎn)高于陽(yáng)性表達(dá)組（44.8%），提示Ⅱ期大腸癌術(shù)后檢測(cè)生存素mRNA或生存素蛋白可作為評(píng)價(jià)大腸癌預(yù)后的客觀指標(biāo)。近來，一些體內(nèi)、外試驗(yàn)研究表明[8]，在生存素陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞株或患者中，對(duì)化療或放療抵抗現(xiàn)象（chemo-radioresistance）普遍，而封閉生存素的表達(dá)則會(huì)增加腫瘤對(duì)放、化療的敏感性。因此，從臨床角度講，生存素陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤患者其治療效果可能不佳，化療耐藥現(xiàn)象可能和一些凋亡抑制基因如生存素有關(guān)。

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