范麗梅,劉國(guó)輝,于金海

(1.長(zhǎng)春市寬關(guān)區(qū)醫(yī)院,吉林長(zhǎng)春130051;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 急診科,吉林 長(zhǎng)春130021;3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院普外科,吉林 長(zhǎng)春130021)

胃癌是死亡率較高的消化道惡性腫瘤,易復(fù)發(fā),5年存活率偏低,因此對(duì)胃癌的早期診斷與治療一直是國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)內(nèi)容,早期診斷是提高5年存活率的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)端粒酶(Telomerase)活性的檢測(cè)對(duì)胃癌是非常有價(jià)值的觀測(cè)指標(biāo),有利于胃癌的早期診斷;血清癌胚抗原(carcino-embryonic antigen CEA)及癌抗原125(carbohydrate antigen125,CA125)檢測(cè)對(duì)胃癌診斷有輔助作用。本文通過對(duì)44例胃癌標(biāo)本中的端粒酶活性及其血清癌胚抗原及癌抗原125的檢測(cè),探討它們?cè)谖赴┰\斷中的臨床意義。

1 材料和方法

1.1臨床資料

1.1.1病例來源 胃癌病人為治療組,取胃腸外科2009年手術(shù)治療的胃癌病人44例,男26例,女18例,年齡(18-68)歲,平均59歲。對(duì)照組為門診胃鏡取胃良性息肉的病人44例,年齡與治療組相當(dāng)。標(biāo)本均于-80℃冰箱中保存?zhèn)涠肆Ｃ富钚詸z測(cè)。兩組均抽血檢測(cè)血清CEA及CA125。

1.1.2病理分期 分期依照UICC1997年標(biāo)準(zhǔn),44例胃癌患者中:Ⅰ期6例,Ⅱ24期例,Ⅲ期以上14例。

1.1.3病理類型 病理分型依照WHO標(biāo)準(zhǔn)。所選取的病人由我院病理科以常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷方法做出。44例胃癌患者病理類型:高分化18例,中分化16例,未分化10例;胃息肉均為良性。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

端粒酶提取 取活檢組織約50 mg于Ep管中用PBS緩沖液洗凈血污,勻漿,加入適量冷PBS于4℃靜置片刻,取上清液200 μ L,離心收集細(xì)胞,立即加裂解液 25 μ L,混 勻,冰浴 30 min,再于 4℃以15 000 r/min離心10 min,取上清液保存于-20℃以備檢測(cè)端粒酶活性。

端粒酶活性檢測(cè) 采用PCR-TRAP法檢測(cè)端粒酶活性,其反應(yīng)混合液中含 20 μ L Tris-HCL(pH 8.3),1 mmol/L MgCl2,63 mmol/L KCl,0.005%Tween 20,1 mmol/L EGTA,50 mmol/LdNTP,1 μ g T4 基因 32蛋白 ,BSA 0.1 μ g/mL,α-32p-dCTP 7.4 kBq,Taq DNA聚合酶 2 IU,TS 引物 0.1 μ g 和蛋白提取物 6 μ g,加高壓去離子水,至終體積25 μ L?；靹蚝?上層覆蓋石蠟油,于37℃保溫 30 min。90℃2 min滅活端粒酶,加CX引物0.01 μ g在 PCR 擴(kuò)增儀上擴(kuò)增,擴(kuò)增條件:94℃變性2 min,95℃40 s,50℃40 s,72℃50 s,共31循環(huán);72℃延伸5 min。取PCR 產(chǎn)物 10 μ L,在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,X線膠片放射自顯影,-80℃24-48 h顯示結(jié)果,出現(xiàn)6 bp梯形帶時(shí)結(jié)果為陽性,每次檢測(cè)以6 μ g Hela細(xì)胞蛋白做陽性對(duì)照。

1.3血清癌胚抗原及癌抗原125檢測(cè)

血清CEA及CA125入院后由檢驗(yàn)科常規(guī)檢測(cè),CEA超過20 ng/ml時(shí)往往提示消化道腫瘤陽性;CA125超過35 U/ml往往提示腫瘤陽性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SAS 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間比較使用 χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1端粒酶、血清CEA、血清CA125在胃癌及胃息肉組織中的表達(dá)胃癌組織的端粒酶、血清CEA、血清CA125陽性表達(dá)與胃息肉組織比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)。胃癌組織端粒酶陽性率高于CEA、CA125陽性率,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2端粒酶、血清CEA、血清CA125在胃癌組織中不同分化程度、不同分期的陽性表達(dá)情況見表2。

表1 胃息肉良性和胃癌患者端粒酶、CEA、CA125陽性率比較[n(%)]

表2 胃癌患者端粒酶、CEA、CA125不同分化程度、不同分期的陽性率比較[n(%)]

胃癌患者端粒酶、CEA、CA125在不同分化程度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＞0.05.CEA、CA125在Ⅲ期-Ⅳ期與Ⅰ期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義均P＜0.05.

2.3端粒酶、血清CEA、血清CA125在胃癌組織的聯(lián)合表達(dá)

端粒酶、血清CEA、血清CA125在胃癌組織表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)。44例胃癌中共有22例端粒酶、血清CEA、血清CA12同時(shí)呈陽性表達(dá),分期晚的病例同時(shí)陽性率較高。

3 討論

端粒是真核細(xì)胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu),由重復(fù)DNA序列及相關(guān)蛋白質(zhì)組成。端粒DNA是由5′TTAGGG3′序列片段重復(fù)構(gòu)成,重復(fù)次數(shù)高達(dá)2000次左右。人端粒的重要功能是保持染色體的完整性,防止染色體DNA降解、末端融合、缺失和非常規(guī)重組。端粒長(zhǎng)度隨著有絲分裂的進(jìn)行而逐漸縮短,當(dāng)端?？s短到一定程度,不能維護(hù)染色體的穩(wěn)定時(shí),則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及衰亡[1]。端粒酶的激活可維持端粒RNA的穩(wěn)定,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

端粒酶是一種核糖核蛋白酶,能延長(zhǎng)端粒末端的特異性逆轉(zhuǎn)錄酶,以自身RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA重復(fù)序列,對(duì)細(xì)胞增殖、衰老和癌變起重要作用[2]。它是一種由端粒酶RNA(hTR)、端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)和端粒酶相關(guān)蛋白1(hTERP1)組成。端粒酶在各類原發(fā)腫瘤中的特異性高表達(dá),惡性腫瘤細(xì)胞中的端粒酶檢出率高達(dá)84%-95%,而良性腫瘤和正常組織中端粒酶檢出率僅為4%左右[3]。因而為胃癌的早期診斷提供新的思維。

Yagihashi研究結(jié)果表明[4]:端粒酶在胃癌的表達(dá)高于腸化生及萎縮性胃炎。Maruyama分析了胃癌、胃腺癌、腸化生時(shí),端粒的長(zhǎng)度與端粒酶活性間的關(guān)系[5],發(fā)現(xiàn)在腸化生及腺瘤組織中的端?？s短及端粒酶活性增高。胃癌時(shí)端粒則延長(zhǎng),端粒酶活性更高,Ahn檢測(cè)胃癌患者端粒酶活性及與DNA聚合酶,K-ras基因點(diǎn)突變的關(guān)系[6],認(rèn)為端粒酶在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起到鑰匙的作用。研究表明端粒酶的異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。此酶在惡性腫瘤中具有活性,而在正常組織或良性腫瘤中失。端粒酶的檢測(cè),有望在臨床診斷及鑒別診斷中發(fā)揮作用。并作為病理及細(xì)胞學(xué)檢查假陰性者一種有價(jià)值的診斷方法。

端粒重復(fù)擴(kuò)增法(TRAP)是檢測(cè)端粒酶催化引物延伸反應(yīng)的產(chǎn)物作PCR模板,通過寡核苷酸引導(dǎo)DNA連續(xù)循環(huán)合成和鏈的分離,使端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)式擴(kuò)增。

CA125是一種相對(duì)分子質(zhì)量為200 kD的糖蛋白,起源于胎兒體腔上皮組織,在血清中CA125以群體形式存在,普遍分布于胸膜、心包、腹膜、子宮內(nèi)膜、生殖道和羊膜等間皮組織細(xì)胞表面。當(dāng)這些部位發(fā)生惡性變或受到炎癥刺激時(shí),血清中CA125的水平將顯著升高。卵巢癌病人組CA125陽性率高達(dá)74.30%,在肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌均有一定比例的升高(陽性率為21.60%-50.75%),由于其具有的高靈敏性和低特異性,在許多良性和惡性病變中均顯示水平升高[7],本研究中良性息肉陽性率9.1%,胃癌中陽性率54.4%。故不能單獨(dú)應(yīng)用,完全不能用做普查篩選。

大腸癌組織可產(chǎn)生一種糖蛋白,作為抗原引起患者的免疫反應(yīng)。此種抗原稱為癌胚抗原(CEA),可廣泛存在于內(nèi)胚葉起源的消化系統(tǒng)癌,也存在于正常胚胎的消化管組織中,在正常人血清中也可有微量存在。癌胚抗原是一個(gè)廣譜性腫瘤標(biāo)志物,它能向人們反映出多種腫瘤的存在,對(duì)大腸癌、胃癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測(cè)估計(jì)是一個(gè)較好的腫瘤標(biāo)志物,但其特異性不強(qiáng),靈敏度不高,對(duì)腫瘤早期診斷作用不明顯。

本研究中早期胃癌CEA、CA125陽性率33.3%,提示此兩種腫瘤標(biāo)志物對(duì)早期胃癌診斷靈敏度低,Ⅲ期-Ⅳ期胃癌陽性率分別為78.9%、71.4%.對(duì)進(jìn)展期胃癌診斷較好。端粒酶、血清CEA、血清CA125呈正相關(guān),提示聯(lián)合檢測(cè)端粒酶、血清CEA、血清CA125對(duì)胃癌的診斷有一定價(jià)值,對(duì)判斷胃癌的發(fā)展程度有指導(dǎo)意義。本研究發(fā)現(xiàn)端粒酶活性檢測(cè)在胃癌早期至晚期陽性率均不低于66.7%,一般高達(dá)83.3%以上?？梢姸肆Ｃ富钚缘臋z測(cè)對(duì)胃癌是非常有價(jià)值的觀測(cè)指標(biāo),有利于胃癌的早期診斷,可能成為胃癌新的分子標(biāo)志物。

[1]Artandi SE,Chang S,Lee SL,et al.Telomere dysfunction promotes nonreciprocal translocations and epithelial cancer inmice[J].Nature,2000,406(6796):461.

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