徐 寧,王 莉,牛爭(zhēng)平,孫美珍

癲癇是腦神經(jīng)元異常放電反復(fù)發(fā)作引起的突然短暫腦功能紊亂的臨床綜合征[1]。中醫(yī)藥治療癲癇已有兩千多年歷史,在治療癲癇方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。半夏超臨界CO2乙醇提取物可劑量依賴性對(duì)抗小鼠最大電休克和戊四唑驚厥[2]。半夏、鉤藤4∶1合用時(shí)抗癲癇效應(yīng)協(xié)同、毒性拮抗[3]。為進(jìn)一步證實(shí)兩藥4∶1配伍后的協(xié)同抗癲癇效應(yīng),本研究進(jìn)一步觀察了半夏、鉤藤提取物單藥及4∶1配伍對(duì)青霉素(PNC)皮層定位注射誘發(fā)大鼠驚厥發(fā)作和癇性放電的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康清潔級(jí) Wistar大鼠,體重180 g～220 g,合格證號(hào)為:314第070102號(hào),雌雄皆用,單籠喂養(yǎng);由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,符合國(guó)家健康一級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 藥品與試劑 藥品:鉤藤(Uncariae,UN)、半夏 Pinellia ternate(PT)均購(gòu)于山西省藥材公司,由山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)系植化教研組老師鑒定。半夏、鉤藤的乙醇回流提取:將生藥材粉碎成 20目,加入相當(dāng)于藥材量的6倍體積的70%乙醇后,浸泡24 h,然后用回流方法加熱煮沸兩次,每次2 h,紗布過(guò)濾,合并兩次濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(濃縮溫度60℃,壓力 9 M pa)濃縮成800%(W/V)溶液,置冰箱冷藏備用,使用時(shí)用蒸餾水稀釋至所需濃度。托吡酯(Topamax),瑞士 Cilag公司生產(chǎn),批號(hào)02CS063。用生理鹽水配制。試劑:青霉素鈉(Benzylpencillin Sodium),華北制藥股份有限公司生產(chǎn),冀衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1995)第000004號(hào),批號(hào)U0204033;烏拉坦(Urethane),上海曹楊第二中學(xué)化工廠生產(chǎn),批號(hào)820420;用蒸餾水配置至所需濃度。

1.1.3 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA,上海亞榮生化儀器廠制造;DZTW型調(diào)溫電熱套,北京市永光明醫(yī)療儀器廠制造;江彎Ⅰ型-C腦立體定向儀,上海川沙花木農(nóng)機(jī)廠制造;RM6240C型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng),成都儀器廠制造。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 取Wistar大鼠稱重并灌胃(ig)受試藥物后,腹腔注射25%烏拉坦 0.4 mL/100 g麻醉,固定于江彎Ⅰ型-C腦立體定向儀上,腦正中矢狀切口切開(kāi)頭皮3cm,剝離骨膜,按照Konig定位圖譜在大鼠左側(cè)額葉皮層(前囟后3 mm,中線旁2 mm,硬腦膜下0.5 mm)和海馬(前囟后3.8 mm,中線旁2.0 mm,硬腦膜下2.6 mm)區(qū)分別將兩根直徑0.5 mm的不銹鋼電極插入相應(yīng)部位作為引導(dǎo)電極,并與RM6240C多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)相連。于各藥作用高峰期用微量注射器硬膜下(感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮層)定位注射青霉素400 U,當(dāng)腦電圖出現(xiàn)尖波、棘波或尖(棘)慢波綜合波時(shí)造模成功。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 取Wistar大鼠36只,隨機(jī)分為5組,每組6只。對(duì)照組(假手術(shù)組)給予生理鹽水;模型組(PNC組)給予生理鹽水;托吡酯組予 0.154 g/kg托吡酯;半夏組予36.4 g/kg半夏;鉤藤組予38.5 g/kg鉤藤;半夏和鉤藤聯(lián)合組予24.5 g/kg;以上各組均采用皮層定位注射給藥。

1.2.3 觀察指標(biāo) 行為觀察參照Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[4]。硬膜下注藥后連續(xù)觀察大鼠行為1 h,并記錄癇性發(fā)作的潛伏期和發(fā)作程度。以注藥到首次出現(xiàn)須動(dòng)所需的時(shí)間為潛伏期;以出現(xiàn)Ⅲ級(jí)～Ⅳ級(jí)發(fā)作為重度發(fā)作,僅出現(xiàn)Ⅲ級(jí)或Ⅲ級(jí)以下輕度發(fā)作。腦電觀察指標(biāo):將電極插入額葉及海馬后與 RM6240C多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)相連,并將腦電信號(hào)輸入電腦,用RM6240C軟件進(jìn)行腦電信號(hào)的頻譜分析。硬膜下微量注射青霉素后,連續(xù)記錄腦電圖5 min,以后每5 min記錄1 min至1 h,同時(shí)觀察大鼠的行為變化。當(dāng)出現(xiàn)尖波、棘波、尖(棘)慢波綜合波、多棘慢波時(shí)判定為癇性活動(dòng)。觀察并統(tǒng)計(jì)癇性放電的潛伏期、放電最高波幅、癲癇波發(fā)放頻率。以注射青霉素到首次出現(xiàn)癇性放電波的時(shí)間為潛伏期,取 10個(gè)1 min EEG中的尖波或棘波數(shù)目的均數(shù)作為每分鐘平均癇波發(fā)放頻率。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)比較 模型組6只大鼠(100%)在注入PNC后開(kāi)始發(fā)作即表現(xiàn)為節(jié)律性四肢同時(shí)抽動(dòng)(Ⅳ級(jí)),持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(1 h)。鉤藤單藥組和半夏單藥組有5只大鼠出現(xiàn)Ⅲ級(jí)以下的輕型發(fā)作,其中只有1只發(fā)展為Ⅳ級(jí)發(fā)作,持續(xù)20 min恢復(fù)正常。聯(lián)用組和托吡酯組各有4只大鼠出現(xiàn)輕型發(fā)作,均未發(fā)展為重型發(fā)作,發(fā)作持續(xù)20 min后轉(zhuǎn)為正常。癇性發(fā)作的潛伏期以聯(lián)用組為最長(zhǎng),依次為托吡酯組、半夏單藥組、鉤藤單藥組。與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與兩單藥組相比,聯(lián)用組均較之延長(zhǎng)(P＜0.05),而與托吡酯組比較在數(shù)值上有所延長(zhǎng),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 半夏、鉤藤提取物對(duì)大鼠驚厥發(fā)作潛伏期和發(fā)作程度的影響

2.2 腦電圖比較 正常大鼠大腦海馬及皮層腦電圖以9/min～10/min或17/min～19/min的α、β波為主要表現(xiàn),無(wú)明顯節(jié)律性,波幅0.04 mV～0.07 mV。正常對(duì)照組大鼠ig后,腦電無(wú)明顯改變。模型組硬膜下注射PNC 63.46 s±11.55 s(海馬),69.73 s±14.04 s(皮層)后開(kāi)始出現(xiàn)癇波,多為尖波、棘波和棘慢波。癇波的發(fā)放頻率為40.17/min±3.97/min(海馬),40.50/min±5.68/min(皮層),波幅最高可達(dá)1.09 mV±0.11 mV(海馬)、1.32 mV±0.36 mV(皮層)。詳見(jiàn)表2、表3。

表2 半夏、鉤藤提取物對(duì)驚厥大鼠海馬癇性放電潛伏期、癇波發(fā)放頻率和最高波幅的影響(±s)

表2 半夏、鉤藤提取物對(duì)驚厥大鼠海馬癇性放電潛伏期、癇波發(fā)放頻率和最高波幅的影響(±s)

組別 劑量 癇性放電潛伏期s癇波發(fā)放頻率t/m最高波幅mV模型組63.46±11.55 40.17±3.97 1.09±0.11半夏組 36.4 g/kg 119.36±17.981) 20.50±7.961) 0.62±0.251)鉤藤組 38.5 g/kg 117.54±12.811) 22.83±9.541) 1.00±0.301)聯(lián)用組 24.5 g/kg 183.26±19.751)2)3)4) 21.17±5.271) 0.82±0.272)托吡酯組 0.154 g/kg 129.04±7.551) 25.00±4.341) 1.13±0.22與模型組比較,1)P＜0.01;與托吡酯組比較,2)P＜0.05;與半夏組比較,3)P＜0.05;與鉤藤組比較,4)P＜0.05

表3 半夏、鉤藤對(duì)驚厥大鼠皮層癇性放電潛伏期、癇波發(fā)放頻率和最高波幅的影響

2.2.1 癇性放電潛伏期比較 海馬腦電圖結(jié)果中癇性放電潛伏期以聯(lián)用組為最長(zhǎng),其余依次為托吡酯、半夏單藥組、鉤藤單藥組,與模型組相比均可延長(zhǎng)癇性放電的潛伏期(P＜0.01)。聯(lián)用組分別與兩單藥組和托吡酯組相比,均能顯著延長(zhǎng)潛伏期(P＜0.05)。皮層腦電圖結(jié)果顯示,皮層癇性放電潛伏期實(shí)驗(yàn)結(jié)果同海馬,只有數(shù)值上的不同。各組皮層和海馬腦電圖的潛伏期的組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2.2 癇性放電頻率比較 海馬腦電圖癇波發(fā)放頻率以半夏單藥組為最少,其余依次為聯(lián)用組、鉤藤單藥組、托吡酯組,與模型組相比癇波發(fā)放頻率均顯著減少(P＜0.01)。聯(lián)用組與兩單藥組相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2.3 癇波最高波幅比較 海馬腦電圖結(jié)果中只有半夏單藥組癇波最高波幅與模型組相比有降低(P＜0.01)。皮層腦電圖結(jié)果可以看出,半夏、鉤藤單藥組癇波最高波幅與模型組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討 論

中醫(yī)理論認(rèn)為,癲癇的病因是由多種因素導(dǎo)致痰濁內(nèi)生,痰聚而氣逆不順,或氣郁化火,火生風(fēng)動(dòng),挾痰上蒙清竅,橫竄經(jīng)絡(luò),內(nèi)擾神明,而致癲癇發(fā)作[5],在治療上以化痰、熄風(fēng)、瀉火、祛瘀、行氣、補(bǔ)氣等為治療原則。中藥配伍是中藥臨床應(yīng)用的主要形式?！侗窘?jīng)》提出充分利用相須、相使等協(xié)同增效配伍,以提高療效;對(duì)有毒副反應(yīng)的藥物,則利用相制配伍,以抑制毒性,保證安全用藥;對(duì)某些確有可能引起藥效下降(相惡)或產(chǎn)生不良反應(yīng)的(相反),則避免合用。馬融等[6]認(rèn)為痰邪是造成癲癇的中心環(huán)節(jié),五志過(guò)極化火生風(fēng)夾痰,上犯清竅;或因臟腑嬌嫩,卒受驚恐,氣機(jī)逆亂,痰濁隨氣上逆,蒙閉心神是本病的主要病機(jī)。按中藥合理配伍原則,本實(shí)驗(yàn)選取平肝熄風(fēng)藥鉤藤和化痰藥半夏提取物進(jìn)行4∶1配伍,觀察了配方的抗驚厥作用。研究表明,半夏和鉤藤合用不但對(duì)抗青霉素誘發(fā)的驚厥行為活動(dòng),同時(shí)可明顯抑制異常腦電活動(dòng)。表現(xiàn)在顯著延長(zhǎng)癇性發(fā)作潛伏期和癇性放電的潛伏期,且該作用較兩藥單獨(dú)應(yīng)用時(shí)強(qiáng)。

青霉素是經(jīng)典的致癇劑,其急性或點(diǎn)燃癲癇動(dòng)物模型已獲公認(rèn)。對(duì)于青霉素誘發(fā)的癲癇活動(dòng)隨其給藥方法的不同而異,如果是腹腔或側(cè)腦室給藥,癇性活動(dòng)與人類失神性癲癇相似,如果是大腦皮層一側(cè)運(yùn)動(dòng)區(qū)定位注射則與人類簡(jiǎn)單部分性發(fā)作類似[7],如果是顳葉給藥,則與人類精神運(yùn)動(dòng)性發(fā)作類似。青霉素為α-氨基丁酸(GABA)受體阻斷劑[8],它引起的發(fā)作可能是由于它與GABA受體結(jié)合,阻斷了與受體偶聯(lián)的氯離子通道,從而阻斷了GABA引起的突觸后抑制的結(jié)果。當(dāng)神經(jīng)元興奮性突觸后電位(EPSP)綜合超過(guò)一定閾值即可產(chǎn)生陣發(fā)性去極化飄移(paroxymal depolarization shifts,PDS)。PDS是癲癇電生理學(xué)的主要特征之一,腦電圖記錄到的棘波就是PDS有關(guān)動(dòng)作電位的反映[9]。半夏和鉤藤乙醇提取物單用和4∶1配伍用藥能明顯抑制青霉素皮層定位注射誘發(fā)的癇性放電,雖然兩藥單用和合用對(duì)癇波發(fā)放頻率及最高波幅的抑制作用無(wú)差異,但延長(zhǎng)癇性放電潛伏期和降低最高波幅作用較托吡酯明顯,且作用性質(zhì)與托吡酯相似。托吡酯能增強(qiáng)小腦顆粒細(xì)胞GABA介導(dǎo)的Cl-內(nèi)流,其抗癲癇機(jī)制可能與GABA系統(tǒng)功能增強(qiáng)有關(guān)[10]。可以認(rèn)為半夏和鉤藤合用通過(guò)抑制青霉素皮層定位注射誘發(fā)的癇性放電和驚厥行為而對(duì)簡(jiǎn)單部分性癲癇發(fā)作產(chǎn)生良好的對(duì)抗作用,推測(cè)其抗癇作用機(jī)制與影響GABA系統(tǒng)有關(guān)。

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