徐隋意,李光來(lái)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一群來(lái)源于中胚層的具有多向分化潛能的非造血系成體干細(xì)胞,因此又被稱為多能干細(xì)胞[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對(duì)組織損傷小不觸及倫理道德問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn),已成為間充質(zhì)干細(xì)胞最主要的來(lái)源[2]。由于BMSCs可誘導(dǎo)分化成如膽堿能[2]、多巴胺能[3,4]等不同遞質(zhì)的神經(jīng)元,BMSCs在治療神經(jīng)內(nèi)科各種疾病如Alzheimer病、Parkinson病等有著不可比擬的優(yōu)勢(shì)。因此本實(shí)驗(yàn)旨在初探GSP對(duì)BMSCs誘導(dǎo)分化后神經(jīng)元樣細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 骨髓取材于山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,Wistar大鼠股骨,LG-DM EM(Hyclone)、兔抗鼠MAP-2(博奧森)、羊抗兔二抗(博士德)、即用型SABC試劑盒(博士德)、4%多聚甲醛、PBS、3%H2O2、倒置顯微鏡、5%CO2培養(yǎng)箱、超潔凈工作臺(tái)、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等。

1.2 BMSCs的分離及體外擴(kuò)增 取成年健康雄性Wistar大鼠,用PBS反復(fù)沖洗去除股骨表面酒精。一次性注射器抽取含有10%FBS及100 U/mL青霉素、鏈霉素雙抗的 LG-DMEM 5mL,反復(fù)沖洗髓腔內(nèi)容物至培養(yǎng)瓶中。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)72 h,使BMSCs充分貼壁。首次半量換液,以后每3 d～4 d根據(jù)細(xì)胞代謝狀況全量換液。待BMSCs在顯微鏡下鋪滿瓶底 90%左右傳代:棄上清,PBS沖洗3遍,加入0.25%胰酶1 mL,同時(shí)鏡下觀察。用無(wú)菌滴管吹打細(xì)胞100次～200次,制成單細(xì)胞懸液。

1.3 GSP干預(yù) 取第5代BMSCs分為 4組:空白對(duì)照組,GSP低濃度組、GSP中濃度組、GSP高濃度組。將培養(yǎng)瓶中上清吸棄,PBS沖洗3遍。空白對(duì)照組加入LG-DMEM 5mL,低中高濃度組分別加入含有GSP 20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L的LG-DMEM 5mL,培養(yǎng)箱孵育24 h。

1.4 BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化[5]將4組培養(yǎng)瓶中上清吸棄,PBS沖洗3遍。加入含有20%胎牛血清的1 mmol/L BME預(yù)誘導(dǎo)24 h,再棄上清,PBS沖洗。加入含有40 ng/mL bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)液誘導(dǎo)24 h。詳見(jiàn)圖1。

圖1 第五代BMSCs及誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)元樣細(xì)胞

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定神經(jīng)細(xì)胞[6]本實(shí)驗(yàn)采用直接在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定。詳見(jiàn)圖2。

圖2 NSE鑒定陽(yáng)性及MAP-2鑒定陽(yáng)性

1.6 M TT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取第五代 BMSCs鋪 96孔板,分組GSP干預(yù)及誘導(dǎo)分化方案同上。待誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞后,每孔加M TT溶液 20 μ L,放入培養(yǎng)箱,孵育24 h后,每孔的顏色變?yōu)榧t中帶藍(lán),吸棄上清,每孔加入150 μ LDMSO,室溫震蕩10 min。此時(shí)顏色變?yōu)樽霞t色,放入酶標(biāo)儀以490 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值。

1.7 神經(jīng)元樣細(xì)胞內(nèi)游離鈣的測(cè)定 以Fluo-3 AM作為鈣離子熒光探針,用流式細(xì)胞儀分別對(duì)空白對(duì)照組,GSP低濃度組、中濃度組、高濃度組干預(yù)后BMSCs誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣細(xì)胞胞漿中的游離鈣檢測(cè)。詳見(jiàn)圖3及圖4。

圖3 空白對(duì)照組及GSP低濃度組

圖4 GSP中濃度組及GSP高濃度組

1.8 神經(jīng)元樣細(xì)胞凋亡率的測(cè)定 以annexin V和PI雙標(biāo)細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀分別對(duì)空白對(duì)照組,GSP低濃度組、GSP中濃度組、GSP高濃度組干預(yù)后BMSCs誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣細(xì)胞檢測(cè)其凋亡率。詳見(jiàn)圖 5及圖 6。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件,各組間均數(shù)比較采用LSD-t檢驗(yàn),P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的分離及體外擴(kuò)增 首次原代培養(yǎng)時(shí)沖洗髓腔得到的細(xì)胞類型較混雜,鏡下甚至有部分腔內(nèi)組織碎塊,血細(xì)胞較多。72 h半量換液后可見(jiàn)部分BMSCs細(xì)胞集落貼于瓶底,呈“菊花”樣或“漩渦”狀排列。每傳代24 h后BM SCs即可恢復(fù)活力,貼壁生長(zhǎng)迅速,約4 d～5 d可鋪滿瓶底。隨著換液次數(shù)的增多,雜細(xì)胞逐漸減少。待BMSCs傳至第五代時(shí),雜細(xì)胞已消失殆盡。此時(shí)BMSCs純度較高,細(xì)胞兩極開(kāi)始有規(guī)律的排列成束狀飽滿梭形。邊界清楚,折光性強(qiáng)。

2.2 GSP干預(yù) BMSCs空白對(duì)照組及GSP低中高各劑量組干預(yù)24 h后,細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。

2.3 BM SCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化 在用含有20%胎牛血清的1 mmol/L BME預(yù)誘導(dǎo)24 h后,部分細(xì)胞胞體回縮變圓鈍,個(gè)別細(xì)胞呈多角形。繼而用含有40 ng/mL bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)液誘導(dǎo)24 h后,細(xì)胞胞體繼續(xù)回縮,伸出軸突樹(shù)突,部分細(xì)胞之間相互連接為網(wǎng)格狀。

2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定神經(jīng)細(xì)胞[7]加入DAB顯色液后,NSE及MAP-2陽(yáng)性細(xì)胞均呈棕黃色。不同的是,NSE陽(yáng)性細(xì)胞為胞體胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒,而MAP-2陽(yáng)性細(xì)胞不僅是胞體內(nèi),部分軸突也染為棕黃色。用蘇木素復(fù)染核后,部分細(xì)胞胞體及核均被染為藍(lán)紫色?？紤]為染色時(shí)間控制不佳所致。

2.5 M TT法檢測(cè)細(xì)胞活力 隨著GSP干預(yù)濃度的升高,OD值也呈正比增高。而OD值間接反映細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶活力,也意味著在GSP濃度為20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L的區(qū)間的,隨著其濃度的提高,細(xì)胞活力不斷增強(qiáng)。

2.6 神經(jīng)元樣細(xì)胞內(nèi)游離鈣的測(cè)定 神經(jīng)元樣細(xì)胞內(nèi)游離鈣的濃度與GSP的干預(yù)濃度呈反比。通過(guò)變化“門(mén)”位反復(fù)取值,經(jīng)LSD-t檢驗(yàn),組間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.7 神經(jīng)元樣細(xì)胞凋亡率的測(cè)定 凋亡細(xì)胞對(duì)所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如PI有抗染性,壞死細(xì)胞則不能。細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光,而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會(huì)有紅色熒光產(chǎn)生。因此,在細(xì)胞凋亡的早期PI不會(huì)著染而沒(méi)有紅色熒光信號(hào)。正?；罴?xì)胞與此相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上,左下象限顯示活細(xì)胞,為(FITC-/PI-);右上象限是非活細(xì)胞,即壞死細(xì)胞,為(FITC+/PI+);而右下象限為凋亡細(xì)胞,顯現(xiàn)(FITC+/PI-)。排除吹打細(xì)胞時(shí)機(jī)械性損傷的因素,隨著GSP干預(yù)濃度的不斷提高,神經(jīng)元樣細(xì)胞的壞死細(xì)胞比例逐漸下降,正常存活細(xì)胞比例逐漸升高。通過(guò)變化“門(mén)”位反復(fù)取值,經(jīng) LSD-t檢驗(yàn),組間兩兩比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討 論

目前已證實(shí)BMSCs可在多種誘導(dǎo)體系下向神經(jīng)細(xì)胞分化[8],如:①化學(xué)誘導(dǎo)方案:B-BME、DMSO、丁羥茴香醚(BHA)、還原型谷胱苷肽(GSH)等。②以提高胞內(nèi)cAMP為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)方案:異丁甲基黃嘌呤(IBM X)和雙丁酰環(huán)腺苷酸(dbcAMP)等。③以細(xì)胞生長(zhǎng)因子為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)方案:神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、腦源性生長(zhǎng)因子(BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)等。本試驗(yàn)采用目前相對(duì)穩(wěn)定成熟的B-BME+bFGF誘導(dǎo)方案。而包括B-BME在內(nèi)的大部分化學(xué)誘導(dǎo)劑有細(xì)胞毒性,影響誘導(dǎo)后細(xì)胞存活時(shí)間與活力。而如何提高細(xì)胞存活時(shí)間及活力,爭(zhēng)取移植有效時(shí)間窗,是影響移植效果的關(guān)鍵,也是目前多直接采用BMSCs移植而非誘導(dǎo)后細(xì)胞移植的原因之一。

本次實(shí)驗(yàn)研究的GSP目前已知的主要功能有[9]:①抗氧化活性,清除自由基:GSP可以有效地清除超氧陰離子自由基和羥基自由基等,也可中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),參與磷脂、花生四烯酸的新陳代謝和蛋白質(zhì)磷酸化,保護(hù)脂質(zhì)免遭病理性的過(guò)氧化損傷;其抗氧化作用高于維生素C20倍,高于維生素 E50倍,是目前已知最強(qiáng)的自由基清除劑。②促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)外Ca2+的穩(wěn)定,減少由于Ca2+異常所造成的細(xì)胞損傷,維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。③可以抑制細(xì)胞凋亡的中間環(huán)節(jié)NF-KB的激活,增加細(xì)胞活力,減少凋亡。

GSP應(yīng)用于心肌細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞等細(xì)胞體內(nèi)及體外培養(yǎng)抗凋亡研究已有諸多報(bào)道。唐瑛等[10]研究發(fā)現(xiàn)GSP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。原慧萍等[11]發(fā)現(xiàn)GSP對(duì)微波誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡有拮抗作用,且濃度在(0～40)mg/L范圍內(nèi)呈正相關(guān)。謝朝陽(yáng)等[12]發(fā)現(xiàn)GSP對(duì)β-淀粉樣肽(25.35)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的凋亡有保護(hù)作用,在(5～50)mg/L的范圍內(nèi)可呈劑量依賴性提高細(xì)胞的存活率。本實(shí)驗(yàn)將目光投到了BMSCs誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)元樣細(xì)胞上。研究結(jié)果提示GSP濃度在(20～80)mg/L的范圍內(nèi),其細(xì)胞保護(hù)作用與濃度變化呈正相關(guān)。不過(guò)其抗凋亡具體中間機(jī)制是通過(guò)上述哪條途徑?還是多途徑聯(lián)合?各個(gè)途徑之間又有什么聯(lián)系?這些問(wèn)題仍有待進(jìn)一步研究。

[1]徐隋意,李光來(lái).人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分析[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(27):5385-5388.

[2]井緒東,陳麗,何冬梅,等.誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2007,11(42):8435-8438.

[3]陳歡意,牛平,趙帥,等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子預(yù)誘導(dǎo)對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的影響[J].臨床神經(jīng)病學(xué)雜志,2007,20(4):274-277.

[4]邢瑩,柴立輝,吳素霞,等.體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2007,23(2)186-190.

[5]劉雪平,姚紅,張捷,等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等體外誘導(dǎo)成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的研究[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2003,20(4):312-314.

[6]連霞,李光來(lái).依達(dá)拉奉對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后神經(jīng)元樣細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2006,4(3):232-234.

[7]王寧,楊樹(shù)源,張文治,等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)向神經(jīng)元分化[J].中華神經(jīng)外科雜志,2005,21(1):55-58.

[8]項(xiàng)正兵,吳曉牧.體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2007,5(7):604-605.

[9]呂麗爽.天然抗氧化劑低聚原花青素的研究進(jìn)展[J].食品科技,2000,23:147-150.

[10]唐瑛,刁波,王曉昆,等.葡萄籽原花青素對(duì)原代培養(yǎng)海馬細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響[J].中藥材,2007,30(12):1555-1558.

[11]原慧萍,馬春陽(yáng),周欣榮,等.原花青素對(duì)微波誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的拮抗作用[J].中國(guó)病理生理雜志,2008,24(4):812-814.

[12]謝朝陽(yáng),梅寒芳,祝其鋒.原花青素對(duì)β-淀粉樣肽(25-35)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2005,25(2):159-161.