周婭紅

安徽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院(合肥230031)

人參是傳統(tǒng)補益中藥，具有補氣生血、扶正祛邪等功效。人參總皂苷(Saponins of panax ginseng，SPG)是人參主要的有效成分之一，研究證實其具有良好的抗病毒、抗衰老、抗氧化等作用［1-3］。本文通過對復(fù)制免疫低下小鼠模型，探討人參皂苷的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料藥物:SPG，安徽省宣城百草植物工貿(mào)有限公司;參芪片，吉林制藥股份有限公司。動物:昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄兼用;ICR小鼠，體質(zhì)量(18±2)g，雌雄兼用。均由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，皖醫(yī)實動準字02號。試劑:注射用環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;印度墨汁，北京西中化工廠;二硝基氟苯，上海試劑一廠。儀器:分光光度計722S，上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品;800B低速離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 人參皂苷對免疫低下小鼠非特異性免疫功能的影響將昆明種小鼠隨機分為正常組、模型組、SPG低劑量組(60mg/kg)、SPG中劑量組(120mg/kg)、SPG高劑量組(240mg/kg)及陽性藥物組(540mg/kg)，每組10只。SPG各組灌胃相應(yīng)劑量的SPG溶液，陽性藥物組灌胃參芪片溶液，每日1次，連續(xù)7d。除正常組外，第3日開始各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg，每日1次，連續(xù)2d。第7日所有小鼠尾靜脈注入離心后的50%印度墨汁(0.01mL/g)，2min和10min后分別摘除眼球取血40μL，并將其加到4mL 0.1%NaHCO3溶液中，在600nm波長測定吸光度值(A)，以正常小鼠血加Na2CO3溶液作空白對照。稱量小鼠體質(zhì)量，頸椎脫臼處死小鼠，分離肝臟、脾臟并稱濕質(zhì)量，按下列公式計算:碳廓清指數(shù)(K)=(lgA1-lgA2)/(T2-T1);吞噬指數(shù)(α)=

1.3 SPG對免疫低下小鼠免疫器官質(zhì)量的影響記錄小鼠體質(zhì)量，頸椎脫臼處死小鼠，取脾、胸腺并稱濕質(zhì)量，以小鼠脾質(zhì)量/體質(zhì)量(mg/10g)和胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量(mg/10g)作為脾臟和胸腺指數(shù)。

1.4 SPG對免疫低下小鼠體液免疫功能的影響

1.4.1 血清IgM溶血素的測定 取昆明種小鼠，分組及給藥方法同“1.2”項。第3日所有小鼠腹腔注射10%SRBC 0.2mL致敏。除正常組外，其余各組同時腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg，連續(xù)2d，制備免疫低下模型。致敏后第5日，摘除眼球取血，收集血清并進行800倍稀釋，吸取0.5mL稀釋血清放入另一試管中，依次加入10%SRBC、補體、生理鹽水各0.5mL，空白管用生理鹽水代替血清。上述試管置37℃溫箱溫育1h，離心5min，取上清液，在540nm波長處測定吸光度值。

1.4.2 血清IgG溶血素的測定 分組、給藥及致敏方法“1.4.1”項，第1次致敏后5d，用同劑量二硝基氟苯再次致敏小鼠，再次免疫后8d摘除眼球取血。血清加等量2-巰基乙醇，于37℃水浴保溫0.5h，隨后將血清800倍稀釋。取2-巰基乙醇處理后的血清0.5mL和5%SRBC 0.5mL，充分混勻，再加羊抗小鼠IgG和補體各0.5mL，空白管以0.5mL生理鹽代替血清。上述試管置37℃溫箱溫育1h，離心，取上清液，在540nm波長處測定吸光度值。

1.5 遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)取ICR小鼠，分組方法同“1.2”項。各組灌胃給予相應(yīng)藥物，連續(xù)9d。第3日除抗原攻擊的正常組外，每只小鼠腹部涂1%二硝基氟苯丙酮麻油溶液50μL致敏(范圍3cm×3cm)。次日同劑量強化1次，除正常組外，各組同時腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg，每日1次，連續(xù)2d，制備免疫低下模型。致敏5d后，將1%二硝基氟苯溶液均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)進行攻擊，對照組同樣涂耳但未致敏。攻擊24h，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用直徑9mm的打孔器打下圓耳片，稱質(zhì)量。以左右耳片之差為腫脹度。

1.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以(x±s)表示，各組均數(shù)之間比較進行one-way ANOVA檢驗。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷對免疫低下小鼠非特異性免疫功能的影響見表1。與正常組相比，模型組小鼠碳廓清指數(shù)(K)和吞噬指數(shù)(α)明顯降低(P＜0.01);與模型組相比，SPG中、高劑量組及陽性藥物組可顯著提高小鼠碳廓清指數(shù)(K)和吞噬指數(shù)(α)(P＜0.05或0.01)，SPG低、中、高劑量組與陽性藥組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);SPG低、中、高劑量組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其中以SPG高劑量組的作用最為明顯。

表1 各組非特異性免疫功能比較 (±s)

表1 各組非特異性免疫功能比較 (±s)

與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01;與正常組比較，△P＜0.05;與陽性藥物組比較，#P＜0.05。下同

組 別n K(10-2)α正常組104.20±0.776.00±0.63模型組102.46±0.84△4.51±0.92△SPG低劑量組102.97±0.735.07±0.57 SPG中劑量組103.22±0.58＊5.36±0.62＊SPG高劑量組103.35±0.66＊＊5.41±1.01＊陽性藥物組103.54±0.87＊＊5.38±0.94＊

2.2 SPG對免疫低下小鼠免疫器官質(zhì)量的影響見表2。與正常組相比，模型組小鼠脾臟器指數(shù)和胸腺臟器指數(shù)顯著降低(P＜0.01);與模型組相比，SPG中、高劑量組及陽性藥物組可顯著提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)(P＜0.05或0.01)，SPG低、中、高劑量組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)，其中以SPG高劑量組的作用最為明顯。

表2 各組免疫器官指數(shù)比較 (mg/g，±s)

表2 各組免疫器官指數(shù)比較 (mg/g，±s)

組 別n脾臟指數(shù) 胸腺指數(shù)正常組104.80±1.024.69±0.99模型組102.66±0.59△2.30±0.43△SPG低劑量組103.14±0.922.79±0.95 SPG中劑量組103.49±0.71＊3.01±0.53＊SPG高劑量組103.82±0.71＊＊3.04±0.61＊陽性藥物組103.83±0.88＊＊2.99±0.51＊??

2.3 SPG對免疫低下小鼠體液免疫功能的影響見表3。與正常組相比，模型組小鼠HCIgM、HCIgG水平顯著降低(P＜0.01);與模型組相比，SPG低、中、高劑量組及陽性藥組可顯著提高環(huán)磷酰胺誘導的免疫低下小鼠HCIgM、HCIgG水平 (P＜0.05或0.01)，SPG低、中、高劑量組與陽性藥物組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);人參皂苷低、中、高劑量組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其中以人參皂苷高劑量組的作用最為明顯。

表3 各組體液免疫功能及耳腫脹度比較 (±s)

表3 各組體液免疫功能及耳腫脹度比較 (±s)

組 別正常組模型組SPG低劑量組SPG劑量組SPG高劑量組陽性藥物組n 10 10 10 10 10 10 HCIgM 55.47±19.56 28.64±3.40△37.94±8.00＊38.14±6.51＊39.62±5.89＊39.28±4.90＊HCIgG 39.32±8.70 27.62±3.94△34.08±6.87＊34.33±5.10＊34.91±6.30＊35.75±6.21＊耳腫脹度3.59±0.49 1.99±0.45△2.46±0.60#2.70±0.63＊3.08±0.65＊＊3.15±0.52＊＊

2.4 SPG對小鼠DTH反應(yīng)的影響見表3。與正常組相比，模型組小鼠耳腫脹程度明顯降低(P＜0.01);與模型組相比，SPG中、高劑量組及陽性藥物組可使小鼠耳片腫脹度顯著增加(P＜0.05或0.01)，SPG低、中、高劑量組與陽性藥物組比較，SPG中、高劑量組無差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，SPG低劑量組作用效果明顯低于陽性藥物組(P＜0.05);SPG低、高劑量組之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示SPG高劑量組作用效果最為明顯。

3 討論

環(huán)磷酰胺是一種烷化類的免疫抑制劑，可殺傷淋巴細胞，抑制免疫反應(yīng)。環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠是研究藥物免疫調(diào)節(jié)作用的經(jīng)典動物模型［4］。機體免疫系統(tǒng)由非特異性免疫、體液免疫和細胞免疫共同構(gòu)成的防御系統(tǒng)。脾臟及胸腺是機體的兩個主要免疫器官，是機體防御機能發(fā)揮的重要環(huán)節(jié)，其臟器指數(shù)是衡量機體免疫功能的初步指標［5］。本實驗結(jié)果表明，SPG低、中、高劑量組之間，各劑量組與陽性藥物之間作用強度差異雖無統(tǒng)計學意義，但SPG中、高劑量組可提高免疫低下小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，提示中、高劑量的SPG能夠?qū)C體細胞免疫和體液免疫功能起到很好的保護。

小鼠碳廓清實驗中所測得的廓清指數(shù)(K)可反映網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，吞噬指數(shù)(α)則反映單核-巨噬細胞的吞噬能力。而單核巨噬細胞的吞噬功能是衡量機體非特異性免疫功能的指標之一［6］。本實驗結(jié)果表明，SPG各劑量組與陽性藥物之間作用強度差異無統(tǒng)計學意義，但SPG中、高劑量組可顯著提高環(huán)磷酰胺誘導的免疫低下小鼠碳廓清指數(shù)(K)值和吞噬指數(shù)(α值)，對免疫低下小鼠的非特異性免疫功能有促進作用。

血清溶血素HCIgM、HCIgG可以代表抗體量，因此HCIgM、HCIgG的水平可以反映體液免疫功能［7］。本實驗結(jié)果表明，SPG低、中、高劑量組可提高明顯提高其低下的HCIgM、HCIgG水平，提示SPG對體液免疫有保護作用，且各劑量組之間、各劑量組與陽性藥物組之間作用強度差異無統(tǒng)計學意義。

DTH是依賴細胞免疫的反應(yīng)，其實質(zhì)是變應(yīng)原引起的T細胞介導為主的炎癥反應(yīng)。變應(yīng)原使TH細胞活化，促使形成致敏的TD和TC細胞，當機體再次接觸相同變應(yīng)原時，TD細胞釋放出多種淋巴因子，導致反應(yīng)局部組織發(fā)生以單核細胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)，與機體細胞免疫能力相一致［8］。本實驗結(jié)果表明，SPG中、高劑量組可使小鼠耳片腫脹度顯著增加，且SPG低劑量組作用強度與人參皂苷中、高劑量組、陽性藥物組相比具有顯著差異，提示SPG中、高劑量組可以改善免疫低下小鼠DTH反應(yīng)，對小鼠特異性細胞免疫功能有促進作用。

綜上所述，SPG對免疫低下小鼠非特異性免疫、體液免疫、細胞免疫功能具有一定的促進作用，以SPG高劑量作用最為顯著，其具體作用機制有待進一步探討。

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