楊廣令,張俊華*,張銀旭,周曉敏

(1遼寧醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,遼寧錦州 121000;2遼寧醫(yī)學(xué)院)

結(jié)直腸癌根治術(shù)后 5 a復(fù)發(fā)率高達(dá) 50%,如何 防治結(jié)直腸癌術(shù)后局部復(fù)發(fā)及肝臟轉(zhuǎn)移是提高其臨床療效的關(guān)鍵所在[1]。氟尿嘧啶(Fu)植入劑(中人氟安)是一種新型的緩釋型化療藥物,能夠在給藥區(qū)域較長(zhǎng)時(shí)間維持較高的、穩(wěn)定的藥物濃度,有利于殺死沒(méi)有切除的亞臨床病灶、微小轉(zhuǎn)移灶及腹腔內(nèi)的游離癌細(xì)胞,但是在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)會(huì)不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良影響尚缺乏一定的基礎(chǔ)研究。2009年 5～6月我們通過(guò)建立大鼠結(jié)腸吻合口模型以探討腹腔植入中人氟安對(duì)大鼠全身及吻合口愈合的影響,為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性大鼠 60只,體質(zhì)量 200～250 g,由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑和器械 5-氟尿嘧啶(5-Fu)注射液,Fu植入劑,考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒和羥脯氨酸測(cè)試盒(消化法)(南京建成生物工程研究所),抗Ⅰ、Ⅲ膠原纖維抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),KT 6180全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀,全自動(dòng)生化儀,菁華 754紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),CH-20光學(xué)顯微鏡。

1.3 動(dòng)物模型制備、分組與處理 大鼠術(shù)前禁食12 h,術(shù)后自由飲水、12 h后少量進(jìn)食。2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后腹部消毒,在劍突下 1 cm處取長(zhǎng)約 3 cm腹正中切口切除約 1 cm結(jié)腸,吻合腸管后逐層關(guān)腹。術(shù)畢將 60只大鼠隨機(jī)分為 A、B、C 3組,每組 20只,組內(nèi)再隨機(jī)分為兩個(gè)亞組各 10只。A組:術(shù)后 24 h腹腔注射生理鹽水(NS)20m l/(kg? d),連用 5 d;B組:腹腔注射 5-Fu 20 ml/(kg? d)+NS 20m l/(kg? d),連用 5 d;C組:術(shù)中在距吻合口約 1 cm外的漿膜層和腸系膜一次性植入中人氟安 20 mg/kg,其中第 1亞組 2只大鼠腸壁上分別固定 3和 6粒中人氟安(約占總藥量的 33%和 50%),第 2亞組 1只在距吻合口約 0.7 cm、另 1只在大鼠腸系膜中供應(yīng)吻合口的血管旁分別固定 5粒中人氟安。A、B、C組均在術(shù)后第 7天處死第 1亞組,第 14天處死第 2亞組。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般狀況 觀察各組大鼠的飲食情況、活動(dòng)、反應(yīng)、精神狀態(tài)和腹部切口愈合情況等,治療期間對(duì)死亡大鼠進(jìn)行解剖以明確死亡原因。于術(shù)后第7天剖腹后觀察腹腔和吻合口的大體形態(tài),并根據(jù)van der Ham等[2]方法進(jìn)行評(píng)分:0分:無(wú)粘連;1分:輕度粘連(主要在吻合口和網(wǎng)膜之間);2分:中度粘連(吻合口和小腸之間,吻合口兩側(cè)與網(wǎng)膜粘連);3分:重度粘連(吻合口周?chē)纬赡撃[)。

1.4.2 血常規(guī)(Rt)及肝、腎功能指標(biāo) 術(shù)后第 7天和第 14天處死大鼠的同時(shí)抽下腔靜脈血 5 ml,測(cè)試 Rt和肝、腎功能。

1.4.3 吻合口破裂壓(ABP) 剖腹后在距吻合口兩端各 3 cm處結(jié)扎腸袢,腸袢一端與微量輸液泵連接,另一端通過(guò)壓力換能器連接電腦,通過(guò) LMS-2B型二道生理記錄儀描記壓力曲線(xiàn)。輸液泵以 2m l/min速度向腸管內(nèi)注入亞甲藍(lán)溶液,觀察到壓力曲線(xiàn)突然下降時(shí)即 ABP。

1.4.4 羥脯氨酸(HYP)測(cè)定 以吻合口為中心切取長(zhǎng) 0.5 cm的腸壁,除凈粘連的組織后稱(chēng)取濕重為40～100mg的組織放入 EP管中,徹底粉碎后分別按考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒和 HYP試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.4.5 病理組織學(xué)檢查 吻合口組織常規(guī)石蠟包埋、切片,做免疫組織化學(xué)染色后顯微鏡觀察并做圖像分析,結(jié)果取像素和面積平均后的乘積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。所有數(shù)據(jù)以±s表示,多個(gè)樣本間總體率的比較用 χ2檢驗(yàn),多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較用最小有意義差異法(LSD法)。以 P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 3組動(dòng)物術(shù)后 12 h后恢復(fù)進(jìn)食,大鼠活動(dòng)力均恢復(fù)正常,對(duì)外界刺激反應(yīng)略遲鈍,精神可。A組無(wú)死亡;B組兩個(gè)亞組分別發(fā)生吻合口漏 4只,死亡 8只;C組第 1亞組發(fā)生腸穿孔 2只,第 2亞組發(fā)生吻合口漏 2只,死亡 4只。各組間死亡率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。術(shù)后第 7天 A、B、C組吻合口評(píng)分分別為 3、12、5分,B組高于 A、C組(P＜0.05)。

2.2 Rt及肝、腎功能 術(shù)后各組間 Rt結(jié)果比較見(jiàn)表 1。術(shù)后第 7天各組間血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)等比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

表1 三組術(shù)后大鼠 Rt結(jié)果比較(×109/L,±s)

表1 三組術(shù)后大鼠 Rt結(jié)果比較(×109/L,±s)

注:與A組比較,*P＜0.05;與 C組比較,△P＜0.05

組別 WBC第 7天 第 14天RBC第 7天 第 14天PLT第 7天 第 14天A組 3.84±0.60△ 1.35±0.23△ 2.46±0.19 2.45±0.24 154.80±86.00 149.30±69.84 B組 0.82±0.29*△ 7.90±3.28*△ 1.64±0.66*△ 2.42±0.31 56.17±42.51*△ 148.50±61.59 C組 6.65±3.14* 3.21±0.32* 2.25±0.12 2.41±0.16 157.88±86.92 149.38±54.06

2.3 ABP和 HYP 術(shù)后三組 ABP和 HYP水平比較見(jiàn)表 2。

表2 三組術(shù)后 ABP和 HYP水平比較(±s)

表2 三組術(shù)后 ABP和 HYP水平比較(±s)

注:與 B組比較,*P＜0.01

組別 ABP(mmHg)第 7天 第 14天HYP(μg/mgprot)第 7天 第 14天A組 129.86±2.78*135.72±0.63 3.45±0.40*4.14±0.30 B組 80.37±25.29 130.90±1.60 2.88±0.36 3.82±0.29 C組 124.48±4.81*132.33±6.54 3.32±0.40*3.98±0.24

2.4 病理組織學(xué) 術(shù)后第 7天吻合口有增生的毛細(xì)血管和大量呈梭形的成纖維細(xì)胞,組織較疏松,并可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn);術(shù)后第 14天吻合口由大量膠原纖維組成,血管及細(xì)胞成分較術(shù)后第 7天減少,組織較致密,可見(jiàn)瘢痕表面有腺體細(xì)胞生成。Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維呈棕黃色顆粒狀或片狀,顯色均在細(xì)胞質(zhì)和膠原特定的區(qū)域,各組Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量比較見(jiàn)表 3。

表3 三組術(shù)后Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量比較(±s)

表3 三組術(shù)后Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量比較(±s)

注:與 A組比較,*P＜0.01;與 B組比較,△P＜0.01

組別 Ⅰ型膠原纖維第 7天 第 14天Ⅲ型膠原纖維第 7天 第 14天A組 1.68±0.10 2.60±0.26 1.48±0.11 2.31±0.19 B組 1.18±0.11*2.54±0.19*1.16±0.10*2.24±0.16*C組 1.53±0.08△ 2.57±0.23△ 1.44±0.09△ 2.28±0.17△

3 討論

多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為術(shù)后早期腹腔化療干擾傷口的正常愈合[3]。腸吻合口愈合時(shí),結(jié)合力的強(qiáng)度主要依賴(lài)于黏膜下層的膠原纖維量[4],其中HYP在膠原中的含量較為穩(wěn)定,約占膠原氨基酸總量的 14%,是膠原纖維的特征性氨基酸,通過(guò)對(duì)創(chuàng)面 HYP含量的測(cè)定可了解創(chuàng)面膠原合成及轉(zhuǎn)運(yùn)情況。而 ABP則為腸內(nèi)壓上升致使吻合口破裂時(shí)的壓力,直接反映吻合口的抗張強(qiáng)度。腸吻合口愈合強(qiáng)度取決于膠原纖維合成與降解的平衡,腸吻合口愈合需要不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)觀察,單一時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果可能得出相左的實(shí)驗(yàn)結(jié)論[5]。

實(shí)驗(yàn)證實(shí) 5-Fu對(duì)消化道腫瘤有確切療效,且5-Fu的療效有明顯的時(shí)間依賴(lài)性即作用時(shí)間越長(zhǎng)療效越好。中人氟安為 Fu的固體緩釋植入劑,植藥 10 d內(nèi)血藥濃度可持續(xù) 0.1μg/m l以上,克服了 5-Fu半衰期短和短時(shí)間內(nèi)血液濃度高所導(dǎo)致的不良反應(yīng)。鑒于此本實(shí)驗(yàn)選擇兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),利用5-Fu按照 Sugarbaker提出的術(shù)后 24 h起連續(xù) 5 d給藥的早期腹腔化療與 Fu植入劑術(shù)中植入化療進(jìn)行對(duì)比,以驗(yàn)證固體緩釋植入劑的安全性。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的藥物劑量換算方法[6],應(yīng)用 5-Fu和 Fu植入劑均為 20 mg/(kg?d)。治療期間 B組發(fā)生吻合口漏 8例,均死亡,說(shuō)明大劑量腹腔化療使吻合口浸潤(rùn)在高藥物濃度中,同時(shí)藥物可以被腹膜很快吸收入血液,使血藥濃度形成瞬時(shí)峰值,影響吻合口細(xì)胞生長(zhǎng),進(jìn)而影響吻合口早期愈合。C組有 2例大鼠腸穿孔,腸壁單點(diǎn)植藥量約占總藥量的 33%和 50%,2例吻合口漏,說(shuō)明 Fu植入劑植入不易距吻合口太近,同時(shí)單點(diǎn)植入不易過(guò)多,特別是大的血管旁和腸壁,以免引起潰瘍而導(dǎo)致穿孔或血管破裂出血,同時(shí)在供應(yīng)吻合口的血管旁亦不易植入過(guò)多,以防影響吻合口愈合。

術(shù)后第 7天 B組大鼠體質(zhì)量略有減輕,剖腹后見(jiàn) B組腹腔粘連較重,個(gè)別大鼠出現(xiàn)腹繭癥[7],吻合口評(píng)分較高,說(shuō)明大劑量 5-Fu腹腔化療能在組織周?chē)脱豪镄纬伤矔r(shí)高的藥物濃度,干擾結(jié)腸吻合口成纖維細(xì)胞及其他正常細(xì)胞的生成,故吻合口脆性較大、抗拉強(qiáng)度低、ABP和 HYP均很低,吻合口漏發(fā)生率增加。C組腹腔粘連較輕,對(duì)骨髓抑制及吻合口周?chē)某衫w維細(xì)胞和其他正常細(xì)胞影響不明顯,吻合口能抵抗一定拉力,ABP和 HYP與 A組相差不大。A、C組 WBC計(jì)數(shù)比較高,C組最高,說(shuō)明 C組除結(jié)腸和腹壁吻合口中的線(xiàn)結(jié)和壞死組織細(xì)胞引起的炎癥外,Fu植入劑藥粒本身也會(huì)引起無(wú)菌性炎癥,同時(shí)它也能使植藥周?chē)募?xì)胞不斷死亡,需要更多的 WBC清除。B組則因大劑量 5-Fu腹腔化療引起骨髓抑制導(dǎo)致全血細(xì)胞減少。術(shù)后第 14天 B組 WBC計(jì)數(shù)最高,表明化療藥物結(jié)束后骨髓抑制狀態(tài)解除,造血系統(tǒng)恢復(fù)造血,同時(shí)吻合口周?chē)驮煅到y(tǒng)有大量壞死組織、細(xì)胞和(或)不成熟細(xì)胞,加上線(xiàn)結(jié)引起的炎癥,使 WBC增多,同時(shí)大劑量化療藥使腹腔粘連較重,部分結(jié)腸處于不完全梗阻狀態(tài),也是WBC增多的原因。C組較第 7天降低,說(shuō)明吻合口部位所引起的炎癥已經(jīng)消退,且 Fu植入劑藥力減弱,周?chē)劳黾?xì)胞減少,為藥粒形成的輕微炎癥反應(yīng)所致。除 WBC外,3組 RBC、PLT、ABP、HYP和Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量均高于術(shù)后第 7天,說(shuō)明大劑量 5-Fu術(shù)后早期腹腔化療影響結(jié)腸吻合口早期愈合,增加腸吻合口瘺發(fā)生率,但并不降低后期結(jié)腸吻合口的抗張力強(qiáng)度。而 Fu植入劑術(shù)后用于腹腔化療并不影響結(jié)腸吻合口的早期愈合,不增加腸吻合口瘺的發(fā)生率,且不會(huì)引起肝、腎損害,為防治結(jié)直腸癌術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供了一種安全、可行的輔助化療方法。

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