朱國坡,周曉麗,郭延鋒,李瑞芳,高均偉,陳仕均,王麗榮,4,劉興友,4*

(1.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué),河南鄭州450002;3.石河子大學(xué),新疆石河子832003;4.動物疫病和殘留物防控河南省高校工程技術(shù)研究中心,河南新鄉(xiāng)453003)

原代細(xì)胞培養(yǎng)因具有細(xì)胞剛剛離體,生物性狀尚未發(fā)生很大變化,具備二倍體的遺傳性、來源方便等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)、細(xì)胞分化、藥物測試等試驗中。在禽類原代細(xì)胞培養(yǎng)中,雞胚成纖維細(xì)胞(chicken embryofibrob last,CEF)得到普遍應(yīng)用。CEF的培養(yǎng)是在一定的條件下,在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境,使從體內(nèi)取出的成纖維組織細(xì)胞生存、生長和傳代,并維持原有組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能特性。早年的組織培養(yǎng)工作者,如Carrel等曾用雞胚做過大量研究工作[1]。與其他細(xì)胞相比,CEF相對容易獲得,而且增殖能力強(qiáng),適應(yīng)性強(qiáng),具有良好的耐受性,性狀比較穩(wěn)定,不易發(fā)生轉(zhuǎn)化[2]。正是具備以上的特點,使得其被廣泛地應(yīng)用于分子和細(xì)胞生物學(xué)的研究的許多方面。

1 雞胚成纖維細(xì)胞的制備

1.1 取材

CEF細(xì)胞的制備一般選用9日齡～11日齡的SPF雞胚,雞胚日齡不宜過大,否則剪碎組織時候較為困難,而且雜細(xì)胞也會較多?？蓞⒖嫉姆椒ㄊ?分別用碘酒和酒精棉由雞胚中央向四周擦拭消毒,然后放入超凈臺,將有氣室的部位朝上,小心地用無菌鑷子磕破蛋殼,沿氣室邊緣夾掉蛋殼,注意不讓蛋殼碎屑落入蛋內(nèi),換用新的無菌鑷子揭開尿囊絨毛膜,再用彎頭鑷子深入胚內(nèi)夾住雞胚頸部取出,放入平皿中,將取出的雞胚去頭、四肢、內(nèi)臟,放入一小燒杯中,然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎,直到成1 mm3左右的小塊,再用HBSS清洗3遍,至組織塊發(fā)白為止[3-6]。

1.2 分離

在培養(yǎng)液中1 mm3的雞胚成纖維細(xì)胞組織塊,僅有少量處于周邊的細(xì)胞可能生存和生長。若要獲得大量生長良好的成纖維細(xì)胞,須將組織分散開,使細(xì)胞解離出來。目前,分離CEF的方法主要是以胰蛋白酶和膠原酶的酶消化法為主。胰蛋白酶適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織(如胚胎、上皮、肝、腎等組織),其消化效果主要與pH、溫度、胰蛋白酶的濃度、組織塊的大小和硬度有關(guān),鈣、鎂離子和血清均對該酶有抑制作用。膠原酶適用于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織等,在鈣、鎂離子和血清存在的情況下仍具有活性,因此使用該酶消化后需要清洗細(xì)胞。相對于胰蛋白酶,膠原酶的價格昂貴,增加了試驗成本,所以研究中胰蛋白酶應(yīng)用最為廣泛?？蓞⒖嫉姆蛛x方法是,將剪碎的組織塊移入廣口瓶中,加入適量的2.5mg/mL胰酶,于37℃水浴中消化30min左右,每隔5 min振蕩1次,使細(xì)胞消化均勻。當(dāng)組織塊變得蓬松透明時,吸棄消化液,用HBSS洗2遍,終止消化。應(yīng)嚴(yán)格控制消化時間,及時終止消化作用,以免過量消化對細(xì)胞的損傷。研究中應(yīng)結(jié)合具體情況而定,如呂利奇等[7]結(jié)合胰酶連續(xù)消化法與玻璃珠分散法制備CEF細(xì)胞,并且認(rèn)為該方法是制備CEF細(xì)胞的最佳方法。

1.3 純化

機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞都混雜生長,因而從體內(nèi)取得的培養(yǎng)材料所做的原代培養(yǎng),絕大多數(shù)都呈混合生長,主要表現(xiàn)為兩大類,即上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞。純化方法分為人工純化和自然純化,人工純化包括酶消化法、機(jī)械劃除法、反復(fù)貼壁法、克隆法、流式細(xì)胞儀分離法等。應(yīng)視具體情況,選擇合適的純化成纖維細(xì)胞的時機(jī)和方法。當(dāng)成纖維細(xì)胞比例較大,上皮樣細(xì)胞生長緩慢、較少時,就不需要做清除處理,通常傳代之后可逐漸自然清除上皮樣細(xì)胞。成纖維細(xì)胞與上皮樣細(xì)胞生長都比較旺盛、且比例相當(dāng)時,應(yīng)盡量等培養(yǎng)物長成單層后處理。這樣成纖維細(xì)胞數(shù)目較多,去除上皮樣細(xì)胞的成功率較高。

研究中多聯(lián)合運用酶消化法和反復(fù)貼壁法來達(dá)到純化成纖維細(xì)胞的目的。由于上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對胰蛋白酶耐受性不同,在消化培養(yǎng)細(xì)胞時,常常是成纖維細(xì)胞先脫壁,而且傳代后貼壁快,附著快,而上皮細(xì)胞在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定,稍振動即浮起,需要生長基質(zhì)如膠原或其他細(xì)胞外基質(zhì)成分等的支持,在原代培養(yǎng)早期此差別尤為明顯,因此,利用這個差別,經(jīng)酶消化法和反復(fù)貼壁法處理2代～3代后,能夠完全純化成纖維細(xì)胞[8]?？蓞⒖挤椒ㄈ缦?將2.5mg/mL胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶2次,稍加搖動,讓胰蛋白酶流過所有細(xì)胞,吸出消化液,將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)纖維樣細(xì)胞變圓,部分脫壁,立即加入有血清的培養(yǎng)液終止消化,用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細(xì)胞生長區(qū)域,將培養(yǎng)瓶中的液體吸出分裝于準(zhǔn)備好的培養(yǎng)瓶中,放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 雞胚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

CEF的培養(yǎng)相對較為容易。首先是培養(yǎng)器皿的選擇,由于CEF貼壁性較好,其對培養(yǎng)器皿的選擇沒有嚴(yán)格的要求,目前大多數(shù)研究者選用塑料、玻璃培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶。為了增加貼壁細(xì)胞的表面積,張立等[9]認(rèn)為膠原型微載體(如GT-2、Cytodex-3)是CEF最適合的微載體。其次是培養(yǎng)基和培養(yǎng)介質(zhì)的選擇,用于CEF的常用培養(yǎng)液有乳漢液、199培養(yǎng)液及DM EM培養(yǎng)液等。多數(shù)研究者一般使用含有血清的DMEM培養(yǎng)基。血清中的生長因子對于成纖維細(xì)胞有較強(qiáng)的促有絲分裂作用,并可通過誘導(dǎo)終末分化抑制上皮細(xì)胞的增殖。研究中添加的血清達(dá)到100 mL/L以上,對于有效抑制上皮細(xì)胞的增殖具有重要作用[10]。另外,不同來源的血清,在培養(yǎng)時雖然質(zhì)量分級一樣,但細(xì)胞生長情況也會有顯著差異,因此在研究同一細(xì)胞時盡量使用同一批次的相同等級血清。再者是培養(yǎng)條件的選擇,動物細(xì)胞一般適宜的pH范圍為7.2～7.4,當(dāng)pH偏低或偏高時均會影響細(xì)胞的正常生長,而向培養(yǎng)基中加入NaHCO3或HEPEs能有效起到平衡的pH的作用。研究中大多數(shù)人用37℃,體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)CEF細(xì)胞,但也有用38.5℃或39℃的培養(yǎng)溫度。

3 雞胚成纖維細(xì)胞的應(yīng)用

CEF細(xì)胞良好的耐受性使之易于進(jìn)行從基因轉(zhuǎn)染到微注射等較多領(lǐng)域的研究,還被廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)研究,同時也是疫苗生產(chǎn)的一種重要的細(xì)胞資源。現(xiàn)在它被用來生產(chǎn)各種雞的疫苗,如傳染性法氏囊病、馬立克病、新城疫疫苗等,也被用來表達(dá)一些基因工程產(chǎn)物。CEF的原代培養(yǎng)在分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)及細(xì)胞工程學(xué)等領(lǐng)域,已發(fā)展成為一門重要的生物技術(shù),并取得顯著成就。

CEF之所以能夠增殖病毒是因為細(xì)胞上有病毒受體。然而Brandt M等[11]研究表明,IBDV超強(qiáng)毒株無CEF細(xì)胞受體,在其傳代致弱過程中,VP2基因的幾處核苷酸改變導(dǎo)致其細(xì)胞嗜性的改變,然而致弱毒株與CEF如何作用及病毒的CEF受體還未見相關(guān)報道。CEF細(xì)胞cDNA文庫的成功構(gòu)建為篩選和研究CEF上病毒受體分子奠定了基礎(chǔ),同時也為研究其他適應(yīng)于CEF上生長的病毒提供可靠的試驗基礎(chǔ),而且文庫也可用于CEF相關(guān)功能蛋白的研究[12-15]。在分子生物學(xué)領(lǐng)域,陳學(xué)輝等[16]用RNA干擾(RNAi)試驗成功阻斷了CEF的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)的表達(dá),傅安靜等[17]用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的GFP-siRNA,成功地干涉了腺病毒載體介導(dǎo)的GFP基因在CEF的表達(dá),這為利用RNAi技術(shù),通過阻斷基因表達(dá)而研究病毒和雞的基因功能奠定了基礎(chǔ);姜世金等[18]利用CEF細(xì)胞來表達(dá)馬立克病病毒(MDV)的pp38基因;Ravindra P V等[19]利用CEF接種新城疫病毒(NDV)后,通過檢測發(fā)現(xiàn)NDV的HN蛋白引起了CEF的細(xì)胞凋亡。另外,高喜梅等[20]利用CEF接種MDV后,用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對CEF的部分染色體上微衛(wèi)星不穩(wěn)定性進(jìn)行了研究;Sharma A等[21]的研究結(jié)果表明,CEF也可用于細(xì)胞毒性的檢測。萬學(xué)琴等[22]采用低血清法培養(yǎng)CEF至單層后,以人白蛋白代替小牛血清培養(yǎng)的NDV的效價和活性符合人用疫苗要求?？傊?隨著CEF培養(yǎng)方法和技術(shù)的成熟,其也將會被應(yīng)用于更廣更深的研究領(lǐng)域。

4 展望

綜上所述,雞CEF是一類較易獲得的細(xì)胞,隨著培養(yǎng)原理與方法的日臻完善,其大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)趨于成熟,以及相應(yīng)細(xì)胞系的建立[23-25],將極大降低在諸多領(lǐng)域的研究困難,將會為研究一些動物和人類疾病發(fā)揮著重要作用。研究表明,CEF的細(xì)胞受體和細(xì)胞嗜性決定病毒是否可以增殖。因此,病毒與CEF如何作用及病毒的CEF受體也成為未來的研究方向。

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