馬力通 ,李 珺,王玉炯

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)生物工程與技術(shù)研究所,包頭 014010;2.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室,銀川 750021)

甘露糖結(jié)合凝集素(mannose binding lectin,MBL)是參加天然免疫的宿主防御分子,它能夠通過凝集素途徑激活補體系統(tǒng)和吞噬作用從而在宿主免疫防御中發(fā)揮重要作用[1]。迄今為止,所發(fā)現(xiàn)的MBL基因結(jié)構(gòu)區(qū)突變均為第1外顯子的點突變,分別是密碼子 54(GGC→GAC,Gly→Asp)、57(GGA→GAA,Gly→Glu)以及密碼子 52(CGT→TGT,Arg→Cys)(簡稱為MBL-54、MBL-57和MBL-52,相應(yīng)突變的等位基因命名為B、C、D,野生型為 A),這些基因的突變干擾了M BL形成穩(wěn)定的功能性的多聚體,使血清中MBL水平下降,從而導(dǎo)致了調(diào)理缺陷,這與臨床反復(fù)感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、艾滋病以及乙型肝炎等多種疾病的發(fā)生相關(guān)。在MBL研究的基礎(chǔ)上,臨床治療中研究者成功嘗試輸入天然血漿MBL或輸入重組M BL來改善由MBL缺失引起的慢性疾病的狀況[2]。MBL基因點突變存在種族差異。目前,尚無寧夏漢族人群MBL基因突變類型及其頻率研究的報道。為此研究中國寧夏漢族人群的MBL基因突變,為進一步了解MBL基因突變與疾病的關(guān)系提供數(shù)據(jù)支持。

1 對象與方法

1.1 研究對象 126名無血緣關(guān)系的健康個體均來自于寧夏地區(qū),其中男84名,女42名,年齡 6～69歲,其父母均為寧夏漢族。在知情同意的原則下,抽取研究個體的外周靜脈血待用。

1.2 MBL基因的擴增 參照文獻[3]提取外周血基因組DNA,以所提取基因組DNA作為模板擴增MBL基因外顯子1,參照文獻[4]設(shè)計引物,引物由華美生物公司合成。引物序列為(1)M BL54和 MBL57的 PCR引物序列,Forward:5′-AGT CGA CCC AGA TTG TAG GAC AGA G-3′,Reverse:5′-AGG ATC CAG GCA GTT TCC TCT GGA AGG-3′。(2)MBL52的 PCR引物序列,Forward:5′-CAT CAA CGG CTT CCC AGG CAA AGA CGC G-3′,Reverse:5′-AGG ATC CAG GCA GT T TCC TCT GGA AGG-3′。PCR反應(yīng)體系為20μ L:基因組 DNA 1.5 μ L,10 ×PCR Buffer 2 μ L,2 μ M 引物各 2 μ L,2.5 mM dNTPs 1.6 μ L,5 u/mL Taq DNA 聚合 酶 0.2 μ L,10.7 μ L ddH2O。PCR反應(yīng)條件為(1)MBL54和 MBL57的反應(yīng)條件:94℃4 min;94℃30 s,58℃40 s,72℃60 s,35個循環(huán);最后72℃5 min。(2)MBL52的反應(yīng)條件:在密碼子52位處利用SDM-PCR引入一個新的酶切位點 MluⅠ,其PCR反應(yīng)條件為94℃4 min;94℃40 s,65℃40 s,72℃60 s,28個循環(huán);最后72℃5 min。PCR擴增產(chǎn)物20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離,在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.3 限制性內(nèi)切酶酶切 酶切反應(yīng)體系15 μ L PCR擴增產(chǎn)物 1.5 μ L,Buffer 2 μ L,BSA 0.2 μ L,限 制性內(nèi)切酶 0.2 μ L,ddH2O 11.1 μ L。PCR 擴增產(chǎn)物分別被 BanⅠ 、MboⅡ 、M luⅠ于50℃、37℃、37℃酶切4～5 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)80 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,電泳結(jié)束后常規(guī)銀染,凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 計算出寧夏漢族MBL基因的各種基因型頻率和等位基因頻率,使用SPSS12.0軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理,利用χ2檢驗分析MBL基因多態(tài)性分布是否符合Hardy-Weinberg平衡以及各組間差異,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MBL基因多態(tài)性PCR-RFLP結(jié)果 見圖1。

圖1 MBL基因多態(tài)性PCR-RFLP結(jié)果

2.2 寧夏漢族MBL基因多態(tài)性分布情況 在寧夏漢族只檢測出兩種等位基因野生型A和變異型B(54位密碼子由GGC→GAC)未檢出變異型C、D等位基因。126名共檢出野生型AA為90名,突變雜合型AB為35名,突變純合型BB為1名;基因型頻率分別為0.714 3,0.277 8,0.007 9;A,B基因頻率分別為0.853 2,0.146 8。經(jīng)χ2檢驗,符合 Hardy-Weinberg平衡定律,說明本研究人群具有群體代表性。

2.3 與其他漢族人群M BL基因多態(tài)性分布的比較 寧夏漢族與廣東漢族[5]均只檢出 A、B兩種等位基因,經(jīng)χ2檢驗,寧夏漢族與廣東漢族[5]之間MBL基因多態(tài)性分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,表1)。并且前者B的等位基因頻率明顯高于后者。

表1 寧夏、廣東兩地漢族MBL基因多態(tài)性分布情況

3 討 論

MBL是第1個被發(fā)現(xiàn)的具有防御功能的C型凝集素。編碼MBL的基因含有4個外顯子,分別編碼N-端富含半胱氨酸區(qū)、膠原樣區(qū)、頸區(qū)和糖識別區(qū)。其中外顯子1編碼N-端富含半胱氨酸區(qū)和部分膠原區(qū)。MBL結(jié)構(gòu)基因外顯子1第52、54、57位的突變使其產(chǎn)物不能形成穩(wěn)定的功能性的多聚體結(jié)構(gòu),從而造成MBL不能發(fā)揮調(diào)理作用和激活補體凝集素途徑的作用。

人群中MBL的基因突變率很高,并且MBL結(jié)構(gòu)基因各點突變的基因頻率與種族有關(guān)。南部非洲人以57位密碼突變多見。MBL-54突變主要發(fā)生在歐洲、亞洲人群中,而在黑人中MBL-54突變極罕見。MBL-52突變少見且種族差別不明顯。國外近年來已在幾個種族人群中研究MBL基因多態(tài)性與感染性疾病、自身免疫性疾病的相關(guān)性[6]。國內(nèi)對漢、維、蒙、藏、彝族的研究中未發(fā)現(xiàn)MBL-52、MBL-57的基因突變,但是MBL-54的基因突變卻很常見[7]。本文所取樣本為一般人群,除了要求為漢族外,未作任何限制,故可以代表寧夏地區(qū)的漢族人群。

本實驗確定了寧夏漢族人群MBL基因多態(tài)性位點等位基因的分布情況,研究結(jié)果顯示,寧夏漢族人群與文獻[5]中的廣東地區(qū)漢族相比較,M BL基因多態(tài)性分布差異顯著,并且寧夏漢族人群B的等位基因頻率明顯高于后者。漢族是中華民族的主要成員。漢族的形成和發(fā)展,經(jīng)歷了一個十分復(fù)雜的融合、遷移的歷史過程,是歷史上融合了許多古代的非漢族人群而形成的。杜若甫和肖春杰[8-9]認為以長江為界,中國漢族人群分南、北兩大類型。各地漢族與當(dāng)?shù)氐纳贁?shù)民族在遺傳結(jié)構(gòu)上十分相近,而南、北方漢族的遺傳結(jié)構(gòu)卻相差甚遠,接近于南、北方少數(shù)民族間的平均差異。寧夏漢族MBL基因多態(tài)性分布與廣東漢族[5]相比有明顯差異,證實了同一人種內(nèi)部MBL各等位基因分布存在地理差異也進一步支持中國漢族人群可分為南北兩類的假設(shè)。同時本研究對寧夏漢族MBL基因多態(tài)性獲得的數(shù)據(jù)為進一步研究MBL基因突變與疾病間的關(guān)系提供數(shù)據(jù)支持。

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