何 艷,付永昕,吳立榮,方 穎,李 屏,李安敏

(貴州省貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內(nèi)科,貴陽 550005)

氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)導致內(nèi)皮功能障礙在動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)病理過程中起關鍵作用[1],植物血凝素樣低密度脂蛋白受體-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1,LOX-1)作為近期發(fā)現(xiàn)的主要在內(nèi)皮細胞表達的ox-LDL特異性受體,介導了ox-LDL對內(nèi)皮細胞的損傷作用[2]。銀杏黃酮苷元(ginkgo aglycone,GA)是通過酸水解-重結晶法去除單糖后獲得的新型銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract,GBE),與傳統(tǒng)GBE比較,具有較強的脂溶性和體內(nèi)生物效價高的特點,目前國內(nèi)外對GBE防治動脈粥樣硬化的實驗研究和臨床應用很多,但對GA的研究卻很少。本研究在培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV304上觀察了不同濃度GA、作用不同時間對 ox-LDL所致的內(nèi)皮細胞表面單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)和LOX-1異常表達的干預,以期為GA進一步用于臨床防治AS性疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV304(中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供)。ox-LDL(中山大學謝志忠博士提供)。DMEM培養(yǎng)基(Gibco)、聚肌苷酸(Polynosinic acid,PIA,Sigma公司生產(chǎn))。新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所提供)?？俁NA提取 Trizol試劑及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerse chain reaction,RT-PCR)試劑盒(北京天根生化科技有限公司生產(chǎn))。MCP-1酶聯(lián)免疫吸附反應(ELISA)試劑盒(Boshide);LOX-1兔抗人多克隆抗體(Sata Cruz);染色體圖像分析儀(Leica);梯度 PCR儀(Eppendorf公司AG22331型);凝膠圖像分析系統(tǒng)(Eppendorf公司AG22331型)。上海捷瑞生物工程有限公司合成引物序列如下,MCP-1mRNA(177 bp)上游引物:5′-AGG AAG ATC TCA GTG CAC AGA GG-3′,下游 引物:5′-AGT CTT CGG AGT TTG GGT T TG-3′;LOX-1mRNA(193 bp)上游引物:TTA CTC TCC ATG GTG GTG CC,下游引物:AGC TTC TTC TGC TTG TTG CC;β-actin mRNA(295 bp)上游引物:5′-TCA CCC ACA ATG TGC CCA TCT ACG A-3′,下游 引物:5′-CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G-3′。 GA由貴州省生化中心何照范教授惠贈(主要成分:槲皮素25.75%、山奈酚15.26%、異鼠李素 1.77%、總黃酮苷元占總成分含量42.79%)。其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV304培養(yǎng) 將所購的人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV304用含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 u/mL硫酸鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育,當細胞生長至80%融合以上時,用體積分數(shù)0.25%胰酶消化后,以1∶2或1∶3傳代,傳代后第2天換液1次,以后每2～3天換液1次,約 3～4 d可長成單層細胞。實驗分組:取對數(shù)生長期細胞,隨機分為對照組(培養(yǎng)基),ox-LDL組(培養(yǎng)基中加入終濃度為50 mg/L的ox-LDL后繼續(xù)培養(yǎng)24 h)、銀杏黃酮苷元濃度效應組(GA6.25、12.5、25、50 mg/L預先培養(yǎng)48 h,然后加入終濃度為50 mg/L的ox-LDL培養(yǎng)24 h),銀杏黃酮苷元時間效應組(GA 25 mg/L預先分別作用6、12、24 h后,加入終濃度為 50 mg/L的ox-LDL培養(yǎng)24 h),LOX-1拮抗劑組(PIA250 mg/L預先作用2 h后,加入終濃度為50 mg/L的 ox-LDL培養(yǎng)24 h)。

1.3 內(nèi)皮細胞形態(tài)學觀察 相差顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)變化。

1.4 M CP-1和LOX-1mRNA測定 樣品總RNA提取采用Trizol試劑盒,操作按試劑盒說明進行。A260/A280測定RNA濃度和純度。采用二步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板進行擴增。PCR反應條件均為94℃預變形5 min,94℃變性30～40 s,55.4～60.5℃退火40 s,72℃延伸1 min,循環(huán)40次,最后72℃延伸 10 min,反應終產(chǎn)物立即進行電泳跑膠,用凝膠圖像分析掃描、電泳結果并照相,測定各條帶吸光度值。以恒定表達的β-actin mRNA作為內(nèi)參進行校正,計算相對表達量。實驗重復3次。

1.5 MCP-1蛋白表達測定 采用ELISA法檢測。常規(guī)消化細胞,將等量細胞懸液分別接種于24孔培養(yǎng)板上,調(diào)整細胞濃度為5×105個/孔,待細胞長成單層貼壁后,按上述試驗分組,達作用時間之后,取細胞培養(yǎng)上清液離心,再收集上清液置于-20℃保存,然后按試劑盒說明操作。置于酶標儀在450 nm處測定OD值,并記錄結果(每組設6個復孔)。

1.6 LOX-1蛋白表達測定 采用SP免疫組化法檢測。用特異性兔抗人 LOX-1多克隆抗體進行細胞免疫組化鑒定,以PBS代替一抗作陰性對照,于顯微鏡下觀察并計數(shù),以胞漿和胞膜著色為棕黃或棕褐色顆粒為LOX-1蛋白表達陽性細胞,計數(shù)陽性細胞數(shù)和染色強度累計積分,結果以均數(shù)表示。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件進行分析,數(shù)據(jù)以表示,多組間比較進行方差齊性檢驗和單因素方差分析(one-way ANOVA),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV304細胞形態(tài)觀察 與對照組比較,銀杏黃酮苷元(≤50 mg/L)對 ECV304生長無影響,細胞貼壁生長,黏附緊密,呈典型的鋪路石樣分布。

2.2 銀杏黃酮苷元對 ox-LDL誘導的臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV304 MCP-1和LOX-1mRNA表達的影響 通過RT-PCR方法檢測各組內(nèi)皮細胞上M CP-1和LOX-1mRNA水平的表達,結果(圖1～3)顯示:與對照組比較,ox-LDL可明顯上調(diào)MCP-1和LOX-1的mRNA表達,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。用GA預處理48 h后,在6.25～50 mg/L濃度范圍內(nèi),均可顯著抑制 ox-LDL誘導內(nèi)皮細胞MCP-1和 LOX-1 mRNA表達;且此效應25 mg/L組大于12.5 mg/L組及6.25 mg/L組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),提示此效應有一定濃度依賴性。

以25 mg/L GA預處理細胞6～24 h,均可顯著抑制ox-LDL誘導細胞MCP-1、LOX-1mRNA表達,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。藥物效應24 h組大于12 h和6 h組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),而 12 h和6 h組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),提示GA與細胞作用6 h后即可發(fā)揮抑制MCP-1和LOX-1mRNA表達的作用,該作用在 24 h時較強。用LOX-1阻斷劑 PIA對細胞進行預處理2 h,可顯著抑制ox-LDL誘導的內(nèi)皮細胞MCP-1和LOX-1mRNA表達。

圖1 各組MCP-1和LOX-1基因的RT-PCR結果

圖2 GA對ox-LDL誘導內(nèi)皮細胞MCP-1表達的影響

圖3 GA對ox-LDL誘導內(nèi)皮細胞LOX-1基因表達的影響

2.3 銀杏黃酮苷元對ox-LDL誘導的內(nèi)皮細胞MCP-1蛋白表達的影響 ELISA法檢測各組細胞MCP-1蛋白表達量,結果(圖4)顯示,ox-LDL作用后,細胞上清液MCP-1的表達量顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。用GA預處理48 h后,在6.25～50 mg/L終濃度范圍內(nèi),可顯著抑制ox-LDL引起的內(nèi)皮細胞MCP-1的分泌,效應有一定的濃度依賴關系,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);用終濃度25 mg/L的 GA預處理6～24 h,可顯著抑制ox-LDL引起的MCP-1分泌,呈時間依賴關系,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.4 銀杏黃酮苷元對ox-LDL誘導的內(nèi)皮細胞LOX-1蛋白表達的影響 通過SP免疫組化法檢測各組細胞LOX-1蛋白表達量,結果(封2圖5、表1)表明:經(jīng) ox-LDL作用后,內(nèi)皮細胞LOX-1蛋白被大量地誘導表達,與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。分別用終濃度25 mg/LGA預處理48 h和250 mg/L LOX-1受體阻斷劑PIA預處理2 h,均可完全阻斷ox-LDL誘導內(nèi)皮細胞 LOX-1蛋白過量表達與ox-LDL組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖4 GA對內(nèi)皮細胞oxLDL誘導內(nèi)皮細胞MCP-1蛋白表達的影響

表1 GA對ox-LDL誘導內(nèi)皮細胞LOX-1蛋白表達的影響

表1 GA對ox-LDL誘導內(nèi)皮細胞LOX-1蛋白表達的影響

*:與對照組比較,P＜0.01;#:與ox-LDL組比較,P＜0.01。

組別 LOX-1蛋白含量對照組(0 mg/L) 7.6±0.8944 ox-LDL 14.6±1.6733*PIA 7.6±1.5166b#G A(25 mg/L) 8.2±0.8367b#

3 討 論

MCP-1作為一種強有力的趨化因子,促進循環(huán)中的單核細胞聚集于血管內(nèi)皮間隙,并促進單核細胞清道夫受體表達,進而攝取脂質(zhì),轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎?成為AS發(fā)生的早期事件。ox-LDL是目前公認的致AS的重要危險因子,導致血管內(nèi)皮細胞功能紊亂,合成和分泌大量黏附分子和趨化因子[3]。研究認為內(nèi)皮細胞通過其表面受體LOX-1吞噬和降解ox-LDL是其功能發(fā)生障礙的主要原因。

近年來GBE在AS防治方面的基礎研究取得了一定的進展。研究發(fā)現(xiàn)GBE增加循環(huán)內(nèi)皮祖細胞端粒酶活性,抑制過氧化氫所致內(nèi)皮細胞凋亡蛋白3活性,促進內(nèi)皮祖細胞增殖,從而促進內(nèi)皮細胞增殖和修復[4-5];干預內(nèi)皮細胞損傷后一氧化氮合酶的表達,改善內(nèi)皮功能[6-7];對AS大鼠致炎細胞因子白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)表達顯著抑制,對抗炎細胞因子白細胞介素-10及其受體表達顯著上調(diào)[8]。

本研究發(fā)現(xiàn),GA可顯著抑制ox-LDL誘導的內(nèi)皮細胞MCP-1表達,且該效應在6.25～25 mg/L范圍內(nèi),具有一定的濃度和時間效應關系。提示GA可能通過影響內(nèi)皮細胞MCP-1表達,減少或預防ox-LDL所致的內(nèi)皮細胞黏附功能紊亂。而GA和LOX-1受體阻斷劑PIA干預LOX-1表達的同時,阻斷了MCP-1的異常合成和分泌,提示LOX-1可能作為一種信號分子參與ox-LDL誘導的內(nèi)皮細胞MCP-1表達的調(diào)節(jié)過程。LOX-1的表達受多種因素包括ox-LDL、TNF、高同型半胱氨酸等調(diào)節(jié),這些物質(zhì)均與體內(nèi)氧化應激相關。核因子-κ B(nuclear factor-κ B,NF-κ B)和激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)是調(diào)節(jié)真核生物氧化還原反應的重要轉(zhuǎn)錄蛋白,在AS氧化應激病理過程中發(fā)揮重要作用。研究表明,LOX-1基因啟動子上存在NF-κ B和AP-1結合位點,而本研究中 GA黃酮含量高達42.79%,黃酮類物質(zhì)是天然抗氧化物家族中的重要成員之一,能有效清除超氧陰離子、羥自由基、一氧化氮等。Chen等[9]研究顯示,GBE可以下調(diào)內(nèi)皮細胞中活性氧族生成,抑制 NF-κ B、AP-1表達。提示GA可能通過干預氧化應激造成的內(nèi)皮細胞LOX-1上調(diào)而抑制MCP-1表達。

因此,銀杏黃酮苷元作為一種新型銀杏葉提取物,能夠顯著下調(diào)ox-LDL誘導的內(nèi)皮細胞LOX-1表達,從而抑制MCP-1的異常合成和分泌,改善內(nèi)皮細胞黏附功能,發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。

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