黃紅杰 平飛云 胡濟(jì)安 趙士芳

（1.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 口腔科，浙江 杭州 310015；2.浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院 口腔科，浙江 杭州 310008；3.浙江大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 口腔病理科；4.口腔頜面外科，浙江 杭州 310006）

Notch信號(hào)途徑的主要受體為Notch1，其是否具有促癌或抑癌作用取決于腫瘤的組織來(lái)源和細(xì)胞類(lèi)型[1-2]，在舌癌中的作用尚未明確。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在舌癌等多種上皮性腫瘤中過(guò)表達(dá)，具有促癌作用[3-4]。近年來(lái)的研究[5-7]表明，Notch1和EGFR信號(hào)途徑在許多腫瘤中存在交互作用，共同調(diào)控細(xì)胞增殖和分化。本課題組在以前的實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了舌癌標(biāo)本中Notch1和EGFR的表達(dá)，推測(cè)Notch1在舌癌中起抑癌作用并與EGFR可能存在交互作用。本實(shí)驗(yàn)將在人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞中進(jìn)一步探討過(guò)表達(dá)外源性Notch1對(duì)細(xì)胞體外生長(zhǎng)和EGFR表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

PRMI1640培養(yǎng)基、TRIzol溶液（Gibco公司，美國(guó)），脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（Invitrogen公司，美國(guó)），甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（Sigma公司，美國(guó)），Taq DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（Promega公司，美國(guó)），一抗Notch1（sc-6014）、EGFR（sc-03）、β-actin（sc-47778）（Santa Cruz公司，美國(guó)），ECL試劑盒（Pierce公司，美國(guó)），SP免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒（北京中杉公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Tca8113細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在含5%CO2的37°C恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3 體外基因轉(zhuǎn)染

編碼Notch1胞內(nèi)域的真核表達(dá)質(zhì)粒pRAMICIRES2-EGFP和對(duì)照質(zhì)粒pIRES2-EGFP由第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳和發(fā)育系張萍惠贈(zèng)。采用LipofectamineTM2000進(jìn)行體外基因轉(zhuǎn)染，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。實(shí)驗(yàn)分3組：目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組。細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，轉(zhuǎn)染日細(xì)胞密度為80%～90%。以O(shè)PTI-MEMⅠ無(wú)血清培養(yǎng)基分別稀釋質(zhì)粒和脂質(zhì)體，室溫孵育5 min后，將上述2組分輕緩混合，室溫下孵育20 min,將混合液加入細(xì)胞中，37°C下繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染8 h后開(kāi)始用熒光倒置顯微鏡觀察并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。在高倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，按發(fā)生綠色熒光的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48 h后收集每組細(xì)胞，用RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)Notch1和EGFR的mRNA和蛋白的相對(duì)水平。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Tca8113細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μL（細(xì)胞密度為每孔2.5×104個(gè)），37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，過(guò)夜后分別用上述方法轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陰性對(duì)照，完全培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。分別于轉(zhuǎn)染后1～4 d每天采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，每一時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔加入10 mg·mL-1MTT溶液10 μL，37 ℃、5%CO2飽和濕度下孵育4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜150 μL，室溫振蕩10 min。酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處光密度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、光密度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染48 h后，收集目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH=7.4）洗1次。用70%冰乙醇1 mL于-20℃下固定過(guò)夜。上機(jī)前離心，棄乙醇，PBS洗2次。加RNase A（終濃度為0.05 g·L-1）10 μL、碘化丙啶250 μL（終濃度為25 μg·mL-1）、PBS 240 μL，混合后室溫避光染色0.5 h。流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)）檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6 RT-PCR檢測(cè)

轉(zhuǎn)染48 h后，分別用TRIzol試劑提取目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞總RNA，總RNA濃度和純度用紫外分光光度計(jì)測(cè)定。各取2 μg總RNA，用M-MLV進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再取等體積cDNA模板進(jìn)行RCR擴(kuò)增，β-actin作為內(nèi)參照。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 3 min，變性94℃ 40 s、退火55℃30 s、延伸72℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)，經(jīng)72℃ 5 min，至4℃。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠作電泳，用凝膠電泳顯像系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories公司，美國(guó)）分析。PCR引物見(jiàn)表1。

表 1 目的基因PCR引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度Tab 1 List of primers used for RT-PCR with corresponding amplicon sizes

1.7 Western blot檢測(cè)

轉(zhuǎn)染48 h后，分別用三去污劑法提取目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞總蛋白，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，各取50 μg蛋白上樣。其操作步驟簡(jiǎn)述如下：蛋白經(jīng)SDS-PAGE 60 V電泳1.5 h后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉37℃下封閉1 h，一抗4℃過(guò)夜，相應(yīng)二抗（1∶3 000）37℃孵育1 h，ECL試劑盒化學(xué)發(fā)光后曝光成像。一抗Notch1、EGFR的工作濃度為1∶200。β-actin（1∶500）作為內(nèi)參。用BandScan5.0軟件進(jìn)行灰度掃描分析蛋白相對(duì)水平。

1.8 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)

細(xì)胞接種前在6孔板底鋪蓋玻片，按上述方法培養(yǎng)細(xì)胞并基因轉(zhuǎn)染。于轉(zhuǎn)染48 h后吸去液體，PBS輕洗、吸干；用4℃純丙酮固定5 min，PBS輕洗5 min×3、吸干。按SP法免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒操作步驟進(jìn)行。鼠抗人EGFR單克隆抗體工作濃度為1∶100。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為光鏡下細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒狀染色，背景清晰；反之，細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)無(wú)棕黃色顆粒染色，則為陰性標(biāo)準(zhǔn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異比較用t檢驗(yàn)和方差分析，Р＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因轉(zhuǎn)染結(jié)果

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞8 h后，在熒光倒置顯微鏡下可觀察到少量綠色熒光表達(dá)細(xì)胞，24 h后表達(dá)量明顯增加，48 h后達(dá)到高峰。轉(zhuǎn)染24 h后，目的質(zhì)粒pRAMIC-IRES2-EGFP和對(duì)照質(zhì)粒pIRES2-EGFP的轉(zhuǎn)染效率分別為69.8%和67.3%（圖1）。

圖 1 Tca8113細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后轉(zhuǎn)染效率 熒光倒置顯微鏡×400Fig 1 Transfection rates of the plasmids in Tca8113 cells fluorescent inverted microscope ×400

2.2 基因轉(zhuǎn)染后Tca8113細(xì)胞增殖的變化

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染編碼Notch1胞內(nèi)域的表達(dá)質(zhì)粒后，Tca8113細(xì)胞增殖受到明顯抑制（Р＜0.05），對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后則無(wú)明顯抑制效應(yīng)（Р＞0.05）（圖2）。

2.3 基因轉(zhuǎn)染后Tca8113細(xì)胞凋亡率的變化

轉(zhuǎn)染48 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率分 別 為 19.51% ±4.12% 、 2.63% ±0.78% 、 2.55% ±0.69%。與對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組相比，目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率增高（P＜0.05），對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖 2 MTT法檢測(cè)Tca8113細(xì)胞增殖Fig 2 The cell proliferation of Tca8113 cells evaluated by MTT assay

2.4 基因轉(zhuǎn)染后Tca8113細(xì)胞Notch1和EGFR表達(dá)的變化

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后，目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的Notch1的mRNA和蛋白的相對(duì)水平分別為1.102±0.135和0.976±0.103、0.243±0.032 和 0.136 ±0.028、 0.265 ±0.039 和 0.138 ±0.029，EGFR的mRNA和蛋白的相對(duì)水平分別為0.083±0.009和0.079±0.008、0.605±0.075和0.554±0.067、0.915±0.115和0.813±0.091（均以β-actin作為內(nèi)參）。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h，RT-PCR檢測(cè)Tca8113細(xì)胞的Notch1和EGFR的mRNA表達(dá)見(jiàn)圖3、4。

圖 3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h，RT-PCR檢測(cè)Tca8113細(xì)胞的Notch1和EGFR的mRNA表達(dá)Fig 3 The mRNA levels of Notch1 and EGFR in Tca8113 cells were detected by RT-PCR

圖 4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h，Western blot檢測(cè)Tca8113細(xì)胞的Notch1和EGFR的蛋白表達(dá)Fig 4 The protein levels of Notch1 and EGFR in Tca8113 cells were detected by Western blot

與未轉(zhuǎn)染組相比，目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的Notch1的mRNA和蛋白分別上調(diào)3.2倍和6.1倍，EGFR的mRNA和蛋白則下調(diào)10.0倍和9.3倍。目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組相比，Notch1的mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)（Р＜0.05），而EGFR的mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)（Р＜0.05）；對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比，Notch1的mRNA和蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Р＞0.05），EGFR mRNA和蛋白的表達(dá)稍有下調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Р＞0.05）（圖3、4）。

2.5 基因轉(zhuǎn)染后Tca8113細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)的變化

Tca8113細(xì)胞在轉(zhuǎn)染編碼Notch1胞內(nèi)域的表達(dá)質(zhì)粒48h后，與對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組相比，EGFR蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率下降，染色強(qiáng)度明顯降低，而對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對(duì)Tca8113細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響（圖5）。

圖 5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，Tca8113細(xì)胞EGFR蛋白的表達(dá) SP ×400Fig 5 The expression of EGFR protein in Tca8113 cells was detected by immunocytochemistry SP ×400

3 討論

Notch信號(hào)途徑通過(guò)相鄰細(xì)胞膜上的受體-配體間相互作用而被激活，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖、分化和凋亡等命運(yùn)決定中起關(guān)鍵作用，其異常調(diào)控可引起腫瘤等多種疾病的發(fā)生[8-10]。現(xiàn)已明確，Notch信號(hào)途徑的主要受體Notch1在大多數(shù)組織中維持細(xì)胞未分化或保持干細(xì)胞狀態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞增殖[8-10]，但在皮膚等組織中Notch1誘導(dǎo)細(xì)胞分化[11-12]。Notch1在許多腫瘤中存在異常表達(dá)。在人低分化乳腺癌[13]和急性T淋巴細(xì)胞白血病[13]中，Notch1過(guò)表達(dá)起促癌作用。在皮膚癌[11-12]和晚期宮頸癌[13]中，Notch1表達(dá)下調(diào)起抑癌作用。舌癌是最常見(jiàn)的口腔癌，起源于舌黏膜上皮基底層中部分角質(zhì)形成細(xì)胞。本課題組在以前的實(shí)驗(yàn)中通過(guò)免疫組化首次檢測(cè)了正常舌黏膜和舌鱗癌標(biāo)本中Notch1的表達(dá)。在正常舌黏膜中，Notch1的陽(yáng)性表達(dá)主要位于角化層及部分顆粒層和棘層細(xì)胞，基底層細(xì)胞無(wú)表達(dá)。這一結(jié)果與Notch1在皮膚中的表達(dá)相似，提示Notch1在正常舌黏膜中誘導(dǎo)細(xì)胞分化。在舌鱗癌標(biāo)本中，Notch1主要表達(dá)于癌巢中鱗狀化生的角化細(xì)胞及類(lèi)棘層細(xì)胞，癌巢周邊細(xì)胞則無(wú)Notch1表達(dá)。這一結(jié)果與Notch1在皮膚癌[11-12]和宮頸癌[13]中的表達(dá)相似。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染上調(diào)Tca8113細(xì)胞Notch1的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果與Duan等[14]報(bào)道的一致。上述結(jié)果提示，Notch1在舌鱗癌中可能起抑癌作用，外源性過(guò)表達(dá)Notch1抑制舌鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

Notch1抑癌作用的分子機(jī)制尚未明確，抗細(xì)胞增殖效應(yīng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用可能是其中的重要機(jī)制。研究[13]發(fā)現(xiàn)，外源性過(guò)表達(dá)Notch1在小細(xì)胞肺癌和肝癌細(xì)胞系中引起細(xì)胞p21waf1/Cip1和p27kip1的上調(diào)，導(dǎo)致G0/G1細(xì)胞周期停止，抑制細(xì)胞增殖，且在肝癌細(xì)胞系中引起細(xì)胞p53的明顯上調(diào)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在皮膚癌[11-12]中則下調(diào)β-連環(huán)蛋白的表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖。Duan等[14]同樣發(fā)現(xiàn)，外源性過(guò)表達(dá)Notch1可能通過(guò)下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)而抑制舌鱗癌細(xì)胞體外增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

Notch1和EGFR信號(hào)通路在不同腫瘤中存在相互協(xié)同或拮抗的交互作用[5-7]，共同調(diào)控細(xì)胞增殖和分化。本課題組在以前的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，EGFR在舌鱗癌標(biāo)本中的表達(dá)與Notch1的明顯不同，EGFR表達(dá)的部位，Notch1失表達(dá)，反之亦然。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，Tca8113細(xì)胞在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染編碼Notch1胞內(nèi)域的表達(dá)載體后，在上調(diào)Notch1的同時(shí)，明顯下調(diào)EGFR表達(dá)。上述結(jié)果提示，Notch1和EGFR信號(hào)途徑可能在舌鱗癌中存在交互拮抗作用，共同調(diào)控細(xì)胞增殖和分化。EGFR信號(hào)途徑維持正常皮膚和黏膜細(xì)胞的未分化狀態(tài)，在皮膚癌和舌癌中持續(xù)激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖，起促癌作用[3-4，15]。而Notch1在皮膚和黏膜中促進(jìn)細(xì)胞分化，在皮膚癌和舌癌中下調(diào)而起抑癌作用。因此，舌鱗癌標(biāo)本及Tca8113細(xì)胞中Notch1的下調(diào)和EGFR的上調(diào)，可能與促進(jìn)癌細(xì)胞增殖有關(guān)，而在鱗狀化生部分Notch1的上調(diào)和EGFR的下調(diào)，可能是癌細(xì)胞分化的標(biāo)志。

Notch1和EGFR交互作用的內(nèi)在機(jī)制目前仍不清楚。最新研究表明，p53可能介導(dǎo)二者的交互作用。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，Notch1和EGFR均過(guò)表達(dá)，p53作為EGFR啟動(dòng)子的激活子介導(dǎo)Notch1對(duì)EGFR的正向調(diào)控，抑制Notch1的表達(dá)，則下調(diào)p53表達(dá)，同時(shí)下調(diào)EGFR的表達(dá)，而外源性過(guò)表達(dá)Notch1，則上調(diào)p53表達(dá)，同時(shí)上調(diào)EGFR的表達(dá)，二者相互協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞增殖[7]。在皮膚癌細(xì)胞中，Notch1和EGFR相互拮抗，EGFR信號(hào)通路通過(guò)下調(diào)p53基因的轉(zhuǎn)錄而負(fù)向調(diào)節(jié)其靶基因Notch1的表達(dá)，抑制細(xì)胞分化，維持增殖狀態(tài)[6]。舌癌與皮膚癌一樣均屬于角質(zhì)形成細(xì)胞來(lái)源的腫瘤，p53是否介導(dǎo)舌鱗癌細(xì)胞中EGFR對(duì)Notch1的負(fù)向調(diào)節(jié)目前仍不清楚。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，舌鱗癌細(xì)胞中存在Notch1對(duì)EGFR的負(fù)向調(diào)節(jié)，p53是否參與其中值得進(jìn)一步探討。

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