王 旭綜述,黃永茂審校

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科,四川瀘州646000)

大腸埃希菌外排泵AcrAB-TolC研究相關(guān)進(jìn)展

王 旭綜述,黃永茂審校

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科,四川瀘州646000)

大腸埃希菌;耐藥;外排泵

細(xì)菌的外排系統(tǒng)是一種非特異性耐藥機(jī)制,是通過細(xì)菌外排泵將進(jìn)入菌體內(nèi)的藥物或其他底物排出膜外,它可以泵出多種對(duì)其自身有害的物質(zhì),包括喹諾酮類、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、青霉素、利福平等多種抗菌藥物、染料和去污劑等,從而加強(qiáng)細(xì)菌在藥物選擇壓力下的生存能力。目前,已在不同細(xì)菌上發(fā)現(xiàn)幾十種外排泵,依據(jù)氨基酸序列的同源性,將與抗菌藥物相關(guān)的膜外排泵分子分為5個(gè)主要超家族[1],包括主要易化子超家族(major facilitato r superfamily,M FS)、A TP結(jié)合盒(A TP binding cassette,ABC)超家族、耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化(resistance nodulation division,RND)超家族、小多重耐藥性(smallmultidrug resistance,SMR)家族、多藥和有毒化合物排出(multidrug and toxic compound extrusion,MA TE)家族。按能量來源不同可分為兩大類:ABC型多藥外排系統(tǒng)和次級(jí)多藥外排系統(tǒng)。大多數(shù)抗菌藥物的外排系統(tǒng)都屬于次級(jí)外排系統(tǒng),多數(shù)細(xì)菌通過質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力來表達(dá)對(duì)不同結(jié)構(gòu)化合物的耐藥。

1980年Bah和M cM urry在研究大腸埃希菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性時(shí)發(fā)現(xiàn)了主動(dòng)外排耐藥機(jī)制,此后人們對(duì)細(xì)菌特別是大腸埃希菌的外排耐藥系統(tǒng)有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。大腸埃希菌是已發(fā)現(xiàn)的主動(dòng)外排泵最多的一種細(xì)菌,存在Bcr、Em rE、EmrAB、Em rD、QacE、AcrAB-TolC、AcrEF、AcrD、YdhV、M dfA等多種外排泵。RND中的AcrAB-TolC蛋白是大腸埃希菌多藥耐藥外排系統(tǒng)中目前研究比較清楚的一種細(xì)菌外排泵。用基因敲除技術(shù)人工去除AcrAB或TolC基因后,大腸埃希菌對(duì)上述藥物的敏感性明顯增加[2]。

1 外排泵AcrAB-TolC的結(jié)構(gòu)和功能

AcrAB-TolC系統(tǒng)主要有3個(gè)部分:膜融合蛋白(AcrA)、外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AcrB)和外膜通道蛋白(TolC)。AcrA、AcrB、TolC以三聚體形式存在于大腸埃希菌細(xì)胞膜上,其中AcrA位于周質(zhì)間隙中,兩端連接著AcrB和TolC;AcrB和TolC分別位于細(xì)胞內(nèi)膜和外膜上。迄今所知,AcrAB-TolC系統(tǒng)可以提供2種途徑對(duì)藥物實(shí)現(xiàn)外排,一種是捕獲胞質(zhì)內(nèi)的藥物,直接穿越雙層膜將藥物排出,比如該系統(tǒng)介導(dǎo)對(duì)氯霉素和四環(huán)素等膜滲透性藥物的耐藥;另一種是捕獲周質(zhì)間隙中的藥物分子,通過TolC將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到外界[2]。

1.1 AcrA蛋白 AcrA是一個(gè)由398個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì),相對(duì)分子質(zhì)量為41 kD,屬膜融合蛋白(membranefusion p rotein,M FP)超家族成員,其脂質(zhì)化的N端錨釘在內(nèi)膜上,C端伸展到周質(zhì)[3]。在周質(zhì)中,AcrA呈高度不對(duì)稱,蛋白質(zhì)的N端和C端不相互接觸,而是分別位于兩端,從而連接AcrB和TolC形成復(fù)合物[4]。AcrA和AcrB位于同一操縱子,兩基因之間無終止信號(hào)。在大腸埃希菌中除AcrB外,AcrA可以與AcrD、AcrF和YhiV等多個(gè)RND家族蛋白作用。AcrA的C端區(qū)域290～357的氨基酸殘基對(duì)于它和AcrB間作用是必須的,這段區(qū)域的局部序列特征對(duì)決定AcrA與AcrB的作用非常重要[4]。AcrA除了作為橋梁連接AcrB和TolC外,也可以有效激活A(yù)crB。Lobedanz等[4]發(fā)現(xiàn),取代AcrA的357～397氨基酸殘基的編碼序列,仍然能夠產(chǎn)生一種功能性蛋白,但并不能使外排功能完全喪失,從而證實(shí)AcrA的290～357殘基區(qū)域在AcrB的激活。

1.2 AcrB蛋白 AcrB由1 048個(gè)氨基酸殘基組成,相對(duì)分子質(zhì)量為110 kD,屬RND家族。AcrB包括12個(gè)親脂區(qū)和2個(gè)親水片段;2個(gè)親水片段是AcrB轉(zhuǎn)運(yùn)子所特有。射線衍射分析顯示,AcrB以同三聚體形式橫跨細(xì)胞內(nèi)膜,在內(nèi)膜的外側(cè)形成漏斗形結(jié)構(gòu),開口于細(xì)胞周質(zhì),能直接攝取細(xì)胞周質(zhì)間隙中的藥物,在內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)形成一個(gè)直徑為30?的中央腔,開口向細(xì)胞質(zhì),漏斗形結(jié)構(gòu)和中央腔相連的部分是個(gè)狹窄或關(guān)閉的孔道[5]。在對(duì)AcrB氨基酸殘基的分析中,研究人員發(fā)現(xiàn)了與底物結(jié)合以及質(zhì)子轉(zhuǎn)移供能相關(guān)的位點(diǎn)。在T(tight)狀態(tài)時(shí), AcrB 2個(gè)周質(zhì)結(jié)構(gòu)域上的F136、178、610、615、617和628; V 139、612;I277、626和位于孔洞結(jié)構(gòu)域的Y327構(gòu)成的疏水區(qū)域,一些化學(xué)性質(zhì)不同的物質(zhì)如羅丹明6G和溴化乙錠(ethidium bromide)等可以進(jìn)入結(jié)合洞穴,通過疏水鍵與中央洞穴結(jié)合[6]。

1.3 TolC蛋白 TolC由495個(gè)氨基酸組成的三聚體,上端為開放結(jié)構(gòu),以便給外排底物提供泵出寬闊通道;下端為封閉結(jié)構(gòu),其中包括一個(gè)10 nm的位于細(xì)胞周質(zhì)的一個(gè)螺旋孔道和一個(gè)4 nm跨越外膜的筒狀結(jié)構(gòu)。它是一個(gè)由TolC基因編碼的多功能的TolC,可以與多種不同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相耦合,在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中幾乎不決定轉(zhuǎn)運(yùn)的特異性和方向[7]。TolC為三聚體,蛋白質(zhì)一部分以螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)入周質(zhì)與AcrA連接,當(dāng)內(nèi)膜AcrB捕獲到細(xì)胞內(nèi)的有害物質(zhì)并與之結(jié)合時(shí),TolC與AcrAB復(fù)合體連接,打開內(nèi)在通道,將有害物質(zhì)排出?；蜓芯孔C實(shí), TolC是AcrAB實(shí)現(xiàn)其功能不可或缺的部分,TolC的作用主要是為藥物分子通過細(xì)菌外膜提供途徑(圖1)。

圖1 大腸埃希菌外排泵AcrAB-TolC結(jié)構(gòu)和功能示意圖

2 AcrAB-TolC的基因調(diào)控

AcrAB的表達(dá)受多種調(diào)控因子的調(diào)節(jié),包括局部和全局兩個(gè)層次調(diào)控。局部調(diào)控常常是在緊鄰其基因的位置上表達(dá)出轉(zhuǎn)錄抑制或激活蛋白,以調(diào)控該泵蛋白的表達(dá)。大腸埃希菌多藥外排泵AcrAB-TolC系統(tǒng)中,AcrA和AcrB蛋白的基因位于同一個(gè)操縱元上,AcrA上游存在著一個(gè)調(diào)控基因,AcrA屬于局部調(diào)控基因[8-10]。全局性的調(diào)控則往往是由細(xì)胞內(nèi)一些整體性調(diào)控因子參加的與細(xì)胞整體代謝變化相關(guān)聯(lián)的調(diào)控機(jī)制。

2.1 局部調(diào)控因子 局部調(diào)控因子AcrR位于轉(zhuǎn)運(yùn)子基因上游,其編碼產(chǎn)物為N末端含有超螺旋結(jié)構(gòu)阻遏調(diào)控蛋白。AcrR為負(fù)調(diào)控蛋白,AcrR作用可以阻遏AcrAB的外排作用,其基因突變可以使AcrAB表達(dá)增強(qiáng),同時(shí)AcrR也可以抑制自身的啟動(dòng)子而調(diào)控自己的表達(dá),從而使耐藥性增強(qiáng)[11]。Webber等[10]對(duì)于不同來源的抗氟喹諾(nuoroquinolone)大腸埃希菌突變型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),它們的AcrB過量表達(dá)并且AcrR第45位氨基酸有突變,利用野生型AcrR對(duì)此種突變型進(jìn)行互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),互補(bǔ)會(huì)導(dǎo)致菌株對(duì)環(huán)丙沙星(cip rofloxacin)和溴化乙錠敏感性增加。在人工突變研究中,Ma將大腸埃希菌Ac-rR插入失活后,AcrAB的轉(zhuǎn)錄水平隨之提高;將AcrR連接到pACYC177上讓其過量表達(dá),會(huì)抑制AcrAB的轉(zhuǎn)錄。

2.2 整體調(diào)控因子 整體調(diào)控因子負(fù)責(zé)誘導(dǎo)這個(gè)外排泵系統(tǒng),增加AcrAB和TolC的轉(zhuǎn)錄,屬于正調(diào)控。目前發(fā)現(xiàn),參與正調(diào)控的因子有MarA、Rob、SoxS和Fis等[12]。

2.2.1 全局性調(diào)控蛋白(MarA) MarA是多重抗菌藥物耐性(multiple antibio tic resistance,M ar)操縱元的轉(zhuǎn)錄激活蛋白,由125個(gè)氨基酸組成的正調(diào)控因子。它可結(jié)合到AcrAB啟動(dòng)子附近,增強(qiáng)RNA聚合酶與該啟動(dòng)子的親合力,促進(jìn)AcrAB的轉(zhuǎn)錄,它也能以同樣的方式提高TolC的表達(dá)。MarA亦可提高自身的轉(zhuǎn)錄水平,MarA作為一個(gè)單體可與MarRAB啟動(dòng)子上方MarO連結(jié),激活MarRAB的轉(zhuǎn)錄,提高M(jìn)arA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量,隨后與MarA調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子鄰近的AcrAB和TolC結(jié)合,促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄[13]。

2.2.2 其他正調(diào)控蛋白(SoxS) SoxS是整體超氧化反應(yīng)(superoxide response,SOX)調(diào)控元SoxRS的效應(yīng)蛋白,是由107個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)。蛋白組學(xué)和遺傳學(xué)常規(guī)分析結(jié)果顯示SoxS可激活17個(gè)基因或操縱子的表達(dá),過氧化物(O2-)可以使SoxR效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)變成它的活化形式(SoxR＊),活化的SoxR進(jìn)而會(huì)促進(jìn)SoxS的產(chǎn)生[13];Rob是由289個(gè)氨基酸組成的能結(jié)合低分子量效應(yīng)基因單獨(dú)區(qū)域的較大蛋白質(zhì),大腸埃希菌中Rob的無意義突變可增加其對(duì)有機(jī)溶劑的敏感性,過量表達(dá)則增加其耐受性[14]。輔助激活蛋白Fis參與到重組和DNA修復(fù)過程,穩(wěn)定某些啟動(dòng)子的局部DNA結(jié)構(gòu),對(duì)應(yīng)不同的生長條件而改變其轉(zhuǎn)錄活性,它也可以促進(jìn)AcrAB轉(zhuǎn)錄。

3 大腸埃希菌外排泵抑制劑的探索

隨著抗菌藥物的大量使用,大腸埃希菌在選擇性壓力下不斷發(fā)展其耐藥機(jī)制,造成日益嚴(yán)重的耐藥問題。探索解決其耐藥方法已經(jīng)刻不容緩,根椐對(duì)大腸埃希菌外排系統(tǒng)的了解和研究,可以從以下2個(gè)方面著手。

3.1 干擾外排泵組裝的抑制劑 Globomycin是一種鏈霉菌來源的環(huán)肽結(jié)構(gòu)的抗菌藥物,它是脂蛋白信號(hào)肽酶LspA的抑制劑,通過抑制LspA從而抑制含有L spA剪接位點(diǎn)的膜融合脂蛋白前體的加工。大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌組成表達(dá)RND型外排泵AcrAB-TolC的組件AcrA前體且含有L spA的剪接位點(diǎn),在Globomycin的作用下不能形成成熟的AcrA,也不能和外排泵的其他組分結(jié)合形成外排泵,抑制了外排泵的作用。文獻(xiàn)報(bào)道75μmol/L Globom ycin能夠使表達(dá)AcrAB-TolC的產(chǎn)氣腸桿菌的氯霉素最低抑菌濃度(M IC)降低至原值的1/4,其外排泵抑制能力與羰酰氰間氯苯腙(carbonyl cyanidemchlorophenylhydrazone,CCCP)(100μmol/L)相同,低于PAβN (100μmol/L,M IC降低至原值的1/8)。

3.2 阻斷外排泵能量來源的抑制劑 大腸埃希菌的外排泵主要由質(zhì)子動(dòng)力勢驅(qū)動(dòng)。對(duì)細(xì)菌多重耐藥外排泵抑制劑的研究發(fā)現(xiàn),以阻斷外排泵能量來源為機(jī)制的外排泵抑制劑主要針對(duì)質(zhì)子動(dòng)力勢[15]。例如CCCP其分子在解離狀態(tài)下,導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白失去能量供應(yīng),破壞外排系統(tǒng)的主動(dòng)外排作用,使藥物在細(xì)菌體內(nèi)的累積量增加,恢復(fù)細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性,因此,它是很強(qiáng)的解耦聯(lián)劑。CCCP作為外排泵抑制劑對(duì)大腸埃希菌AcrAB和AcrEF、產(chǎn)氣腸桿菌AcrAB-TolC、空腸彎曲桿菌CmeABC等均有抑制作用。例如,100μmol/L的CCCP可以使表達(dá)AcrAB-TolC的產(chǎn)氣腸桿菌的氯霉素M IC降低至原值的1/4[16]。

4 展 望

目前,對(duì)大腸埃希菌的外排泵的結(jié)構(gòu)、調(diào)控方式及如何抑制它的外排泵有了一定的認(rèn)識(shí)和了解,但是研究僅限于體外實(shí)驗(yàn),并且這些抑制劑大多對(duì)人體有不良反應(yīng)。許多在體外活性良好的外排泵抑制劑由于安全性、特異性、機(jī)制明確性等諸多問題未能用于臨床治療。外排泵抑制劑不僅可以提高具有外排泵介導(dǎo)耐藥性的病原細(xì)菌的藥物敏感性,恢復(fù)抗菌藥物的抗菌活性,還有利于減少由外排作用促進(jìn)的耐藥突變株的產(chǎn)生。除了對(duì)外排泵抑制劑的研究還需要臨床工作者注意合理使用抗菌藥物。(1)根據(jù)體外檢測藥敏結(jié)果使用抗菌藥物,對(duì)患者實(shí)行個(gè)體化用藥;(2)抗菌藥物的劑量要適當(dāng),注意由于劑量不足而造成耐藥性的產(chǎn)生,療程應(yīng)盡量短;(3)根據(jù)細(xì)菌耐藥和發(fā)展趨勢,有計(jì)劃地將抗菌藥物分批分期交替使用可能是一項(xiàng)重要措施;(4)在醫(yī)院內(nèi)嚴(yán)格執(zhí)行消毒隔離制度,以防耐藥菌的交叉感染[17]。因此,尋找有應(yīng)用前景的外排泵抑制劑并合理使用抗菌藥物對(duì)于細(xì)菌性感染的治療有著深遠(yuǎn)的意義。

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