陳義發(fā),尹輝,梁賓勇,黃致遠,劉洪亮,陳孝平,龔非力

(1.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院外科學(xué)系,武漢 430030; 2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系,武漢 430030)

研究報告

兩種異位心臟移植小鼠模型的建立和比較

陳義發(fā)1,尹輝2,梁賓勇1,黃致遠1,劉洪亮1,陳孝平1,龔非力2

(1.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院外科學(xué)系,武漢 430030; 2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系,武漢 430030)

目的 比較腹部和頸部小鼠心臟移植模型的優(yōu)缺點,探討二次器官移植或雙心臟移植研究的可行性和實用性動物模型。方法參照Ono法和Chen法并加以改進,建立了同系或者同種小鼠腹部和頸部異位心臟移植模型,同時對兩種手術(shù)方式的成功率、手術(shù)時間、移植心臟存活時間和病理組織學(xué)進行了比較。結(jié)果腹部和頸部異位心臟移植手術(shù)成功率分別為86.7%和83.3%,兩種手術(shù)方式在總手術(shù)時間、移植心臟存活時間和病理組織形態(tài)學(xué)檢查上均無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論在熟練掌握顯微外科技術(shù)的基礎(chǔ)上,兩種異位心臟移植模型都能順利建立,兩者既可分開選用,又可結(jié)合運用,以適應(yīng)不同實驗需求。

心臟移植;動物模型;小鼠

心臟移植動物模型是進行移植免疫學(xué)研究的重要工具,由于近交系小鼠的品種較多,以及多種檢測試劑和單克隆抗體來源于小鼠,還可減少藥物用量,節(jié)省開支,因而小鼠在心臟移植免疫研究中占有了不可替代的地位。目前,小鼠異位心臟移植模型的建立方法通常有兩種:腹腔異位心臟移植術(shù)[1,2]和頸部異位心臟移植術(shù)[3],兩種方法各有特點,可根據(jù)實驗條件選用。兩種異位移植模型若能結(jié)合運用,將為今后的二次器官移植和移植排斥反應(yīng)的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物:雄性近交系BALB/c小鼠與C57BL/6小鼠選自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)院器官移植研究所實驗動物中心【SCXK(滬)2007-0005】,體質(zhì)量22～25g。所有動物均飼養(yǎng)于清潔環(huán)境。

1.1.2 手術(shù)器械:顯微外科手術(shù)器械為上海手術(shù)器械廠產(chǎn)品;YZ20 PS手術(shù)顯微鏡購自蘇州醫(yī)療儀器總廠;無創(chuàng)性血管夾,上海手術(shù)器械廠生產(chǎn);3/0、5/0和11/0無損傷縫合線,上海醫(yī)用縫合針廠生產(chǎn)。

1.1.3 麻醉藥物:0.5%戊巴比妥鈉按15 mL/(kg ·bw)腹腔注射。

1.2 實驗分組

動物實驗分為四組:I組采用腹腔異位心臟移植術(shù),以C57BL/6小鼠為供者和受者的同系移植;II組采用腹腔異位心臟移植術(shù),以BALB/c小鼠為供者,C57BL/6小鼠為受者的同種異體移植;III組采用頸部異位心臟移植術(shù),以C57BL/6小鼠為供者和受者的同系移植; IV組采用頸部異位心臟移植術(shù),以BALB/c小鼠為供者、C57BL/6小鼠為受者的同種異體移植。每組均進行15次移植手術(shù),移植總數(shù)為60次,其中供、受者小鼠各60只。

1.3 供心切取手術(shù)

小鼠麻醉后仰臥位固定,行腹正中線切口,暴露下腔靜脈并緩慢注入100 U/mL肝素生理鹽水0.5 mL,1～2 m in后橫斷腹主動脈和下腔靜脈放血。迅速打開胸腔,0～4℃生理鹽水停搏心臟,去除周圍脂肪組織及胸腺,分別在靠近右心房處分離結(jié)扎下腔靜脈和右上腔靜脈,遠端剪斷。游離升主動脈、無名動脈和肺動脈:如果采用腹部異位心臟移植術(shù),則游離升主動脈并在無名動脈分支處近心端剪斷,游離肺動脈主干并在分支處剪斷;如果采用頸部異位心臟移植術(shù),則在無名動脈分支處遠心端結(jié)扎主動脈,遠端剪斷,然后在無名動脈分支處遠心端剪斷,游離肺動脈主干并在分支處剪斷。然后用5/0縫合線結(jié)扎左上腔靜脈、左肺靜脈和右肺靜脈以及周圍組織,并在遠心端剪斷,全心修剪后放入0～4℃生理鹽水保存。

1.4 受者手術(shù)

吻合血管時,以冰鹽水棉片保護供心,棉片周圍覆以冰屑以防移植心臟復(fù)溫造成熱缺血損傷。

1.4.1 小鼠腹部異位心臟移植術(shù):①移植部位的準備:沿腹正中線剪開小鼠腹腔,將胃、小腸、結(jié)腸等腹腔器官用溫生理鹽水紗布包裹,提向切口右上方。打開后腹膜,充分顯露腹主動脈和下腔靜脈腹腔段全長,剝離兩根血管前方及周圍的軟組織,小心分離相鄰的兩根血管,上至腎動、靜脈分支處,下至髂內(nèi)、外血管分支處。下腔靜脈在此段有2～3處腰靜脈的匯入支,分別結(jié)扎后切斷,用5/0縫合線在游離開的兩根血管近心端和遠心端各結(jié)扎一道,不必過緊,以正好阻斷血流為度。②供心植入:在兩根結(jié)扎線中間處,微微提起腹主動脈前壁,剪一個與供心主動脈口徑相適的“0”形孔,用肝素等滲鹽水沖凈血管內(nèi)血液。供心主動脈與受者腹主動脈進行端側(cè)吻合,其方法:從兩動脈外側(cè)壁開始,采用連續(xù)外翻縫合法,鏡下邊距1 mm,針距1 mm,一般約需縫4～5針?？p合后,將供心翻向?qū)?cè),接外側(cè)壁的縫合線,繼續(xù)用連續(xù)外翻法縫合動脈內(nèi)側(cè)壁。隨后在下腔靜脈前壁,剪一個與供心肺動脈口徑相適的“0”形孔,用肝素生理鹽水沖凈血管內(nèi)血液。同樣,肺動脈和下腔靜脈進行端側(cè)吻合,采用連續(xù)外翻縫合法。鏡下針距和邊距均為2 mm。需要注意的是,靜脈內(nèi)側(cè)壁吻合是在血管內(nèi)進行,此處要形成吻合口管壁外翻,則需要使用血管外吻合時的連續(xù)內(nèi)翻縫合技術(shù)?？p線兩端打結(jié)時,尤其是靜脈需計算并預(yù)留出血管充盈后的距離。動、靜脈血管吻合即將結(jié)束前,用肝素生理鹽水充盈血管,將血管內(nèi)空氣排除干凈。吻合完畢后先開放遠心端血管,隨后間斷開放近心端血管,小的出血點可以壓迫止血,也可以縫合出血點。恢復(fù)血供后,供心于1～2 m in內(nèi)由纖顫轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)跳,檢查無出血,擺正供心位置,用3/0縫合線連續(xù)縫合關(guān)閉皮膚切口。

1.4.2 小鼠頸部異位心臟移植術(shù):①移植部位的準備:從右下頜中點至右鎖骨中點處剪一長約1cm斜切口,分離皮下組織,游離右側(cè)頸外靜脈,在遠心端分支處用5/0縫合線結(jié)扎,微血管夾近心端阻斷靜脈,并在遠心端橫斷;切斷右側(cè)胸鎖乳突肌,游離右頸總動脈至頸內(nèi)、外動脈分叉處,結(jié)扎頸總動脈,微血管夾阻斷近心端,橫斷頸總動脈。②供心植入術(shù):供心主動脈與受者頸總動脈進行端端吻合,采用間斷外翻縫合法。以冰鹽水紗布包裹供心置于受者右頸部,注意調(diào)整好供心位置以利吻合。其方法:先在3點(時鐘定位法,下同)處吻合一針,然后在對側(cè)9點處吻合第二針,前壁11點及1點處各吻合一針,翻轉(zhuǎn)微血管夾暴露后壁,在后壁7點及5點處各吻合一針,然后恢復(fù)至原來的位置(共計6針)。注意盡可能保持邊距及針距均勻?qū)ΨQ。供心肺動脈與受者頸外靜脈同樣進行端端吻合,采用連續(xù)縫合法。具體為先在3點處吻合一針打結(jié),在原位由外向內(nèi)向肺動脈內(nèi)進一針,然后由右向左腔內(nèi)連續(xù)縫合至對側(cè)9點處,再由左向右腔外連續(xù)縫合至3點起始處,不必打結(jié),留線頭約0.5cm,共縫約8～10針。吻合完畢后先開放靜脈,若吻合口有滲血,可用小棉球輕壓片刻即可,一般不需補針。隨后開放動脈,若吻合口有出血,可間斷開閉微血管夾,減輕吻合口壓力,一般在3～5 m in內(nèi)間斷開放2～3次可以止血,如仍出血可考慮補針。開放后1～2 m in內(nèi)供心即可由纖顫轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)跳。調(diào)整移植心臟于合適位置以防血管扭曲,待移植心臟復(fù)跳穩(wěn)定,用3/0縫合線連續(xù)縫合皮膚切口。

1.5 術(shù)后處理和觀察

所有受者術(shù)后給予5%葡萄糖等滲鹽水0.4 mL,皮下注射。術(shù)后小鼠多于1 h內(nèi)蘇醒,每日作腹部或頸部觸診,了解移植心臟搏動情況。移植心臟搏動72 h以上計為手術(shù)成功。

1.6 病理檢查

術(shù)后7 d分別切取同系移植和同種移植組心臟各6只,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡檢查心肌結(jié)構(gòu)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,采用t檢驗, P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)成功率

腹腔異位心臟移植I組和II組的手術(shù)總成功率達86.7%(26/30),4次手術(shù)失敗的原因均為動脈吻合口出血。頸部心臟移植III組和 IV組的手術(shù)總成功率達83.3%(25/30),5次手術(shù)失敗,原因為動脈吻合口狹窄、血栓形成3次,吻合口出血2次。結(jié)果顯示,兩種手術(shù)方式的成功率差異無顯著性(P>0.05)。

2.2 手術(shù)時間

兩種小鼠異位心臟移植術(shù)中供者手術(shù)方法有所不同,差異在于主動脈與肺動脈之間游離的長度,行頸部異位心臟移植術(shù)時要充分分離出無名動脈,因此時間長于腹腔異位心臟移植術(shù)。在受體手術(shù)方法上存在差異,腹腔異位心臟移植術(shù)在受體準備時間和供心植入時間略長于頸部異位心臟移植術(shù)。但在整個手術(shù)時間上(見表1),從供者剪開腹正中線到受者縫好皮膚,腹腔異位心臟移植術(shù)(79.1±4.9 m in),頸部異位心臟移植術(shù)(74.9±4.4 m in)的差異無顯著性(P>0.05)。

2.3 移植心臟存活時間

同系與同種異位心臟移植術(shù)相比,同系移植組的移植心臟平均存活時間超過100 d,而同種移植組的移植心臟平均存活時間分別是腹腔異位心臟移植術(shù)為7.4±1.0 d和頸部異位心臟移植術(shù)為7.5± 0.9 d,兩者相比差異無顯著性(P>0.05)。

2.4 病理檢查

在移植后第7天病理學(xué)檢查,兩種移植術(shù)在同種移植組均顯示移植心肌呈彌漫性多種類型細胞浸潤,伴有明顯的水腫、出血和心肌細胞壞死;而在同系移植組均顯示心肌結(jié)構(gòu)無損傷表現(xiàn)。

表1 小鼠腹腔異位心臟移植和頸部異位心臟移植的手術(shù)時間比較(±s,m in)Tab.1 Comparison of the operation tim e of celiac and cervical heterotop ic heart transp lantations in the m ice(±s,m in)

表1 小鼠腹腔異位心臟移植和頸部異位心臟移植的手術(shù)時間比較(±s,m in)Tab.1 Comparison of the operation tim e of celiac and cervical heterotop ic heart transp lantations in the m ice(±s,m in)

手術(shù)進展時間Time of operation p rocedure移植部位Transp lantation site 供心準備Preparation of donor受者準備Preparation of recip ient動脈吻合Anastomosis of artery靜脈吻合Anastomosis of vein總時間Total time腹腔Abdom inal cavity 10.5±1.6 12.4±2.3 18.9±2.3 23.5±2.7 79.1±4.9頸部Cervical part 12.8±1.7 11.7±1.8 17.0±2.2 17.9±2.2 74.9±4.4

3 討論

嚙齒類動物帶血管的異位心臟移植模型是進行移植排斥和免疫耐受研究較為理想的工具,其中大鼠異位心臟移植由于動物體型較大,較容易復(fù)制成功,而小鼠體型較小,對顯微外科的設(shè)備和技術(shù)要求比較高,模型建立難度較大。但小鼠具有其他動物品系無法替代的優(yōu)點:豐富的遺傳背景資料,且H-2系統(tǒng)與人類HLA系統(tǒng)具有高度的相似性;近交系品種繁多可供選擇空間大,診斷試劑齊全;實驗成本低,適合于價值昂貴的新型免疫抑制劑和藥物研究,結(jié)果可重復(fù)性好。隨著二次移植手術(shù)在臨床器官移植中的需求日益突出,其免疫相關(guān)機制勢必更加復(fù)雜,因此,研究如何建立和應(yīng)用不同小鼠異位心臟移植模型顯得尤為重要。

目前小鼠異位心臟移植模型所采用的手術(shù)方式分為兩種,區(qū)別在于供心植入的部位不同。腹腔異位心臟移植術(shù)是將供心移植于受者腹腔,供心主動脈與受者腹主動脈、供心肺動脈與受者下腔靜脈做端側(cè)吻合;頸部異位心臟移植術(shù)則是將供心移植于受者頸部,供心主動脈與受者頸總動脈、供心肺動脈與受者頸外靜脈進行端端吻合。根據(jù)文獻報道和我們的實驗證實,兩種手術(shù)方式與同種異體移植排斥反應(yīng)的強度無相關(guān)性,同種供心移植的存活時間為6～9 d,而同系移植存活時間均大于100 d以上,結(jié)果提示可重復(fù)性好,兩種模型的手術(shù)方式均穩(wěn)定可行。只要能熟練掌握顯微血管吻合技術(shù),兩種手術(shù)方式的成功率和手術(shù)時間均無明顯差異,可根據(jù)實驗設(shè)計安排合理運用。結(jié)合在異位心臟移植模型建立過程中的改進和體會,總結(jié)兩種手術(shù)方法各自的特點,供選擇時參考。

1969年,Ono[4]克服了Abbott氏腹腔異位心臟模型的主要缺點,將端端吻合改為端側(cè)吻合術(shù)后,顯著提高了術(shù)后模型存活率,從而得以廣泛應(yīng)用。其主要特點為腹腔空間大,操作簡便,術(shù)后發(fā)生血管扭轉(zhuǎn)所造成的移植物非免疫排斥幾率小。小鼠腹主動脈與頸總動脈相比,管徑粗,僅需在25倍手術(shù)顯微鏡下就能完成手術(shù),吻合成功率高。開腹手術(shù)會增加感染機會,也會加重受者損傷,但可通過加強圍手術(shù)期護理和使用抗生素來降低其發(fā)生率。在對受體小鼠腹主動脈和下腔靜脈的阻斷和吻合過程中,我們對Ono法進行了改進。由于腹主動脈和下腔靜脈粘連非常緊密,過度分離易造成出血,并且細小分支的存在,導(dǎo)致可供吻合的區(qū)域非常狹小,故我們在打開后腹膜時,只將腹主動脈和下腔靜脈與周圍組織游離,既可防止血管分離時出血又可減少血管游離時間;動靜脈近心端和遠心端分別用5/0縫合線同時結(jié)扎阻斷,可為供吻合的血管提供足夠的長度。吻合前先用5號針穿刺腹主動脈壁,再沿穿刺孔剪開,進行主動脈-腹主動脈吻合,隨后在下腔靜脈壁上開口,進行肺動脈-下腔靜脈吻合,這樣有效克服靜脈在吻合時的顯露不充分的困難。小鼠頸部心臟移植模型由Chen[3]1991年創(chuàng)建,其主要特點有:小鼠頸部血管解剖清楚,頸外靜脈和頸總動脈分開走行,分離血管相對容易;動脈和靜脈吻合采用的是端端吻合方式,手術(shù)較靈活方便;頸部手術(shù)切口小,造成的損傷小,術(shù)后恢復(fù)快,感染率低。但也有明顯的不足,由于頸總動脈直徑小,至少需要30倍手術(shù)顯微鏡才能完成吻合,顯微技術(shù)難度較大。

小鼠異位心臟移植已成為移植免疫和藥理等研究的重要模型,特別是在近些年來對二次移植免疫和慢性排斥反應(yīng)研究日趨深入的過程中,顯示出無與比擬的優(yōu)越性。腹腔異位心臟移植和頸部異位心臟移植的手術(shù)方式均與移植排斥反應(yīng)強度無相關(guān)性,顯示了兩種模型穩(wěn)定性好,變異率小的優(yōu)點。只要經(jīng)過顯微手術(shù)訓(xùn)練,掌握血管吻合技巧,兩種模型的手術(shù)成功率都將超過80%,兩者差異無顯著性,因此,可根據(jù)不同實驗室的具體條件,靈活選用其中的手術(shù)方式之一,而在建立二次移植模型時則可同時選用兩種手術(shù)方式,將為解決臨床器官二次移植所面臨的困難提供新的實驗依據(jù)。

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[2] Chen YF,Dem ir Y,Valu jsk ikh A,et al.Antigen location contributes to the patho logical featu res of a transp lan ted heart graft[J].Am J Patho l,2004,164:1407–1415.

[3] Chen ZH.A new technique of cervical heterotop ic heart transp lantation in m ice[J].Transp lantation,1991,52:1099-1101.

[4] Ono K,L indsey ES. Imp roved technique of heart transp lantation in rats[J].J Thorac Cardiovasc Surg,1969,57:225-229.

Estab lishm en t and Com par ison of TwoM ouse M odels of Celiac and Cerv ica l Heterotop ic Hear t Tran sp lan ta tion

CHEN Yi-fa1,Y IN Hui2,L IANGB in-yong1,HUANG Zhi-yuan1, L IU Hong-liang1,CHEN X iao-p ing1,GONG Fei-li2
(1.Departm ent of Surgery,Tongji Hosp ital,2.Departm ent of Imm uno logy,HuazhongUniversity of Science and Techno logy,W uhan,430030,China)
Corresponding authors:CHEN X iao-p ing,E-m ail:chenxp@m edm ail.com.cn and GONG Fei-li,Em ail:flgong@163.com

Heart transp lantation,celiac;Heart transp lantation,cervical;Anim almodel;M ouse

R654.28

A

1005-4847(2010)01-0017-04【Abstract】 O b jective O b jective In order to better keep up w ith the developm ent of transp lantation imm unobiology, we estab lished and compared two types of mouse heterotop ic heart transp lantation,and hope to help further organ transp lantation studies.M ethods A ccording to the surgicalp roceduresofOno’s type and Chen’s type ofmousemodelof heterotop ic heart transp lantation w ith som e modification,we perfo r m ed celiac and cervical heteropotic heart transp lantation betw een iso-strains and hetero-strains,and compared the operation success rate,operation tim e,allograft survival t im e, and histopatho logy of those estab lishm ent m ethods.ResultsThe success rates of mouse celiac and cervical hetero top ic heart transp lantation were 86.7%and 83.3%,respectively,w ith a non-significant difference(P>0.05)between the two m ethods of operation regarding the total operation tim e,survival tim e of the allografts,and histopatho logical findings. Conc lusion s Based on the m astery ofm icrosurgical techniques,the two models of heterotop ic mouse heart transp lantation can be estab lished equally,and either of them can be considered depending on the particular requirem ents of studies.

2009-04-16

國家自然科學(xué)基金資助項目(30571754,30671900);留學(xué)回國人員科研啟動基金教外司留[2005]383號;國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃(973)項目(No.2001cb500008);教育部博士點基金項目(No.20040487056)。

陳義發(fā)(1963-),男,副教授,博士。研究方向:移植免疫。E-mail:yfchen@tjh.tjmu.edu.cn

陳孝平,E-mail:chenxp@medm ail.com.cn;龔非力,E-mail:flgong@163.com