楊玉琴,馮潔,王學(xué)斌,謝建云,高誠(chéng),胡建華

(1.復(fù)旦大學(xué),上海 200032;2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)督檢驗(yàn)站,上海 201203; 3.上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所,上海 200032;4.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,揚(yáng)州 225009)

研究報(bào)告

東方田鼠三個(gè)脂肪肝相關(guān)基因的克隆及分析

楊玉琴1,馮潔2,3,王學(xué)斌4,謝建云2,3,高誠(chéng)2,胡建華2

(1.復(fù)旦大學(xué),上海 200032;2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)督檢驗(yàn)站,上海 201203; 3.上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所,上海 200032;4.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,揚(yáng)州 225009)

目的 克隆CYP2E1、CYP2D 5、ECHS1三個(gè)與非酒精性脂肪肝可能相關(guān)基因的cDNA全長(zhǎng)基因,為進(jìn)一步研究非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。方法利用S MART技術(shù)構(gòu)建東方田鼠肝臟cDNA質(zhì)粒文庫(kù),通過PCR方法篩選文庫(kù),獲得目的菌落,用pB luescrip t II SK通用引物M 13R測(cè)序,獲得基因全長(zhǎng)序列,并進(jìn)行序列分析比較。結(jié)果篩選了CYP2E1、CYP2D5、ECHS1三個(gè)基因,并獲得了它們的全長(zhǎng)cDNA序列:CYP2E1基因cDNA全長(zhǎng)為1685bp,有1482 bp的完整開放閱讀框,編碼494個(gè)氨基酸;CYP2D 5基因cDNA全長(zhǎng)為1690 bp,有1514 bp的完整開放閱讀框,編碼504個(gè)氨基酸;ECHS1基因cDNA全長(zhǎng)為1013 bp,有873 bp的完整開放閱讀框,編碼290個(gè)氨基酸。這三個(gè)基因的核酸序列及其推測(cè)的氨基酸序列與人、大小鼠序列高度同源。結(jié)論獲得了東方田鼠CYP2E1、CYP2D 5、ECHS1三個(gè)基因全長(zhǎng)cDNA序列,并已在Genbank中登錄(GQ507485、GQ507486、GQ845171),為東方田鼠非酒精性脂肪肝模型的研究奠定了基礎(chǔ)。

東方田鼠;cDNA序列;非酒精性脂肪肝

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是以無過量飲酒史(酒精攝入量< 20 g/d)以及肝細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變、彌散性肝小葉輕度炎癥和(或)肝中央靜脈、肝竇周圍膠原沉積等為臨床病理特點(diǎn)的慢性肝臟疾病[1]。近年來,由于飲食結(jié)構(gòu)的變化,非酒精性脂肪肝的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示脂肪肝患者已占到平均人口的10%～24%。脂肪肝已成為僅次于病毒性肝炎的第二位常見肝病,在發(fā)達(dá)國(guó)家已成為第一位常見肝病,且有發(fā)展至肝硬化、肝癌、肝衰竭的危險(xiǎn)[2],成為全球普遍關(guān)注的醫(yī)學(xué)問題和社會(huì)問題。但非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確,目前認(rèn)為非酒精性脂肪肝病變的產(chǎn)生是多基因共同參與的結(jié)果。

細(xì)胞色素P450是位于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一組混合功能氧化酶系,是肝臟代謝最主要的酶系之一,定位于肝微粒體,主要參與各種內(nèi)源性和外源性化合物在體內(nèi)的代謝過程,可能與肝臟脂肪病變有密切關(guān)系[3],其中細(xì)胞色素P4502E1(cytochrome P4502E1, CYP2E1)在肝細(xì)胞物質(zhì)代謝方面起主要作用[3,4]。高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠P4502E1活性明顯升高[5], CYP2E1還參與肝細(xì)胞的氧應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥因子形成及星狀細(xì)胞激活等過程[6,7]。CPY2D 5也是細(xì)胞色素P450家族的成員,參與許多內(nèi)源性化合物和外源性人造化學(xué)物質(zhì)的氧化代謝反應(yīng),包括類固醇、脂肪酸、類視黃醇、膽汁酸、生物胺等[8]。烯酰輔酶A水合酶短鏈1(enoyl coenzym e A hydratase,short chain 1,ECHS1)也與脂肪酸代謝有密切關(guān)系,它是線粒體脂肪酸β氧化中的關(guān)鍵酶,在水化反應(yīng)中催化烯脂酰輔酶A生成L-β-羥脂酰輔酶A,若ECHS1的表達(dá)量降低就會(huì)使脂肪酸β氧化減少或停止,使儲(chǔ)存在肝臟中的大量的脂肪酸不能被氧化供能,在肝細(xì)胞內(nèi)堆積形成脂肪肝。并且它還是參與膽固醇代謝的一個(gè)非常重要的基因[9]。

為了研究和探討非酒精性脂肪肝在東方田鼠中的發(fā)病機(jī)制,我們首先用S MART技術(shù)構(gòu)建了東方田鼠肝臟cDNA質(zhì)粒文庫(kù),并通過PCR方法篩選文庫(kù)獲得這三個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng)序列,為接下來研究上述基因與非酒精性脂肪肝的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。(滬)2008-0016]。

1.2 試劑

Trizo l reagent、1 kb DNA ladder m arker及2 kb DNA ladder m arker購(gòu)自Gibco BRL公司;O ligo tex mRNA kits和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Q iagen公司; S MARTTMcDNA質(zhì)粒文庫(kù)構(gòu)建試劑盒為美國(guó)C lontech公司,IPTG和X-gal為上海生工生物工程技術(shù)有限公司產(chǎn)品;rTaq聚合酶(5 U/μL)、感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 cDNA文庫(kù)構(gòu)建:取東方田鼠肝臟,用異硫氰酸胍法按Gibco BRL公司Trizol reagent操作說明書提取總RNA;mRNA的純化按照Q iagen公司O ligotexmRNA Kits操作說明進(jìn)行;再按S MARTTMcDNA質(zhì)粒文庫(kù)構(gòu)建試劑盒操作說明書建立cDNA質(zhì)粒文庫(kù):取純化后mRNA加入S MART IV O ligo nuc leotide、CDS III/3′PCR p rim er合成cDNA第一鏈,用LD PCR擴(kuò)增26個(gè)循環(huán)合成雙鏈cDNA,接著制備cDNA Sfi I粘性末端并純化,加入Sfi I改造的pB luescrip t II SK克隆載體,16℃連接過夜,使目的基因連接在Sfi I改造的的pB luescrip t IISK載體上,構(gòu)建東方田鼠肝臟的cDNA質(zhì)粒文庫(kù)。

1.3.2 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成:參照NCB I中大小鼠CYP2E1、CYP2D 5、ECHS1三個(gè)基因序列,進(jìn)行序列同源比對(duì)得到這三個(gè)基因cDNA序列的保守區(qū),在cDNA保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物(見表1),引物由上海申能博彩生物技術(shù)有限公司合成。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)洞庭湖種群12周齡東方田鼠4只,來源于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK

表1 篩選東方田鼠CYP2E1、CYP2D 5、ECHS1基因PCR引物Tab.1 PCR p rim er sequences fo r cloning of M icrotus fortis CYP2E1,CYP2D 5,ECHS1 genes

1.3.3 全長(zhǎng)cDNA克隆:①東方田鼠cDNA文庫(kù)的轉(zhuǎn)化:取100μL感受態(tài)細(xì)胞,加入1μL東方田鼠cDNA文庫(kù),輕輕混勻后冰浴30 m in,42℃熱激90 s,立即冰浴2 m in,加900μL SOC培養(yǎng)基,37℃250 r/m in搖45 m in,3000 r/m in離心5 m in,沉淀加入100μL SOC吹打重懸后,取出10μL菌液涂加AM P的LB瓊脂板,置37℃培養(yǎng)箱中過夜。次日挑取白色菌落,加入5 mL LB溶液中,搖菌過夜。②目的基因的PCR篩選:把所有菌液按每30管一組分組,每管取等量菌液混合做為PCR初篩模板,取1 μL混合菌液,加入上、下游引物(20μmo l/L)各0.4 μL、M gC l21.6μL、dNTPs(2.5 mmol/L)0.4μL、PCR buffer 2μL、Taq po lym erase 0.2μL、水14μL,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。程序如下:94℃變性5 m in進(jìn)入循環(huán); 95℃30 s,53℃45 s,72℃2 m in,38個(gè)循環(huán)后,72℃延伸10 m in。反應(yīng)結(jié)束后,取2μL產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。對(duì)檢出陽(yáng)性條帶的混合菌液,把所有單管菌液再按照上述步驟進(jìn)行PCR篩選,將出現(xiàn)目的條帶的菌液送上海英俊公司用pB luescrip t II SK通用引物M 13R CAGGAAACAGCTATGACC在AB I3730型全自動(dòng)序列分析儀上測(cè)序。

1.3.4 基因序列分析:在NCB I網(wǎng)站中收集人類、大鼠、小鼠上述基因的cDNA全長(zhǎng)序列,通過BLAST與測(cè)得的東方田鼠基因序列進(jìn)行比對(duì),分析同源性,并找出啟動(dòng)子和終止密碼子。推測(cè)其氨基酸序列,并對(duì)東方田鼠上述基因的氨基酸序列與人類及大小鼠的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 東方田鼠肝臟cDNA文庫(kù)構(gòu)建

經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成,PCR擴(kuò)增的雙鏈cDNA,分布呈彌散狀,符合文庫(kù)構(gòu)建要求。cDNA Sfi I粘性末端制備及純化后電泳顯示雙鏈cDNA主要分布于500～4000 bp之間,呈彌散狀條帶,符合建庫(kù)要求(圖1)。該cDNA文庫(kù)的滴度為1076 p fu/μL,重組率約94%,庫(kù)容量達(dá)1.08×106,完整性基因的比率為77.3%。

1～11:經(jīng)CHROMA SP IN-400凝膠層析柱純化cDNA;M:1kb DNA ladder圖1 Sfi I消化后分級(jí)分離的cDNA電泳結(jié)果1-11:cDNA purified by CHROMA SP IN-400 gel colum n chromatography;M:1kb DNA ladderF ig.1 cDNA after Sfi I digestion and c lassified separation

2.2 三個(gè)基因全長(zhǎng)cDNA的獲取

通過兩輪PCR篩選(圖2),從文庫(kù)中獲得目的菌落。用pB luescrip t II SK通用物M 13R測(cè)序,獲得了東方田鼠CYP2E1、CYP2D5、ECHS1三個(gè)基因的全長(zhǎng)序列。

CYP2E1基因全長(zhǎng)為1685 bp,37-39位為起始密碼子ATG,其上游有統(tǒng)一閱讀框終止密碼子TGA,開放閱讀框(ORE)為1482 bp,編碼494個(gè)氨基酸,1513位為終止密碼子TAA,其下游有加尾信號(hào)及polyA尾。CYP2D5基因全長(zhǎng)1690 bp,92-94位為起始密碼子ATG,其上游有統(tǒng)一閱讀框終止密碼子TGA,開放閱讀框(ORE)含1514 bp,編碼504個(gè)氨基酸,1605位為終止密碼子TAA,其下游有加尾信號(hào)及po lyA尾。ECHS1基因全長(zhǎng)為1013 bp,35-37位為起始密碼子ATG,其上游有統(tǒng)一閱讀框終止密碼子TGA,開放閱讀框(ORE)長(zhǎng)度為873 bp,編碼290個(gè)氨基酸,907位為終止密碼子TAA,其下游有加尾信號(hào)及po lyA尾。以上三個(gè)基因已在GenBank中注冊(cè),注冊(cè)號(hào)分別為GQ507485、GQ507486、GQ845171。

1～7:待測(cè)細(xì)菌克隆,M:2 kb DNA ladder圖2 東方田鼠cDNA文庫(kù)PCR篩選電泳結(jié)果1-7:the testing clone;M:2 kb DNA ladderF ig.2 The screening resu lts of M icrotus fortis liver cDNA p lasm id library

2.3 同源性分析

2.3.1 核酸水平比較:通過與其他動(dòng)物CYP2E1基因比較發(fā)現(xiàn),東方田鼠CYP2E1基因m RNA與人、大鼠、小鼠同源性分別為80%、90%和89%。東方田鼠CYP2D 5基因m RNA與大鼠有85%的同源性。東方田鼠ECHS1與人、大鼠、小鼠mRNA的同源性分別為85%、91%和90%。

2.3.2 氨基酸水平比較:通過相似性比較軟件(B lastp)non-redundant p rotein sequences(nr)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比較發(fā)現(xiàn),東方田鼠CYP2E1基因在氨基酸水平上與大鼠、人類和小鼠的同源性分別為96%、91%和94%;CYP2D 5基因與大鼠的同源性為87%;ECHS1基因與大鼠、人類和小鼠的同源性分別為97%、91%和85%(圖3～5)。

＊和○分別表示相同及相似氨基酸圖3 東方田鼠與大鼠CYP2D 5氨基酸序列同源性比較＊and○rep resent the identity and sim ilar am ino acid residues,respectivelyF ig.3 Comparison of the deduced am ino acid sequences of CYP2D 5 between M icrotus fortis and Ra ttus norvegicus

3 討論

東方田鼠(M icrotus fortis)隸屬于嚙齒目(Roden t)、倉(cāng)鼠科(Cricetidae)、田鼠亞科(M icrotinae)、田鼠屬(M icrotus),是我國(guó)常見的嚙齒類動(dòng)物,主要分布于我國(guó)東北、西北及南方地區(qū)[10]。東方田鼠是農(nóng)作物的重要害鼠,又是多種人獸共患病的自然宿主,國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)其生態(tài)學(xué)、行為學(xué)等作了一系列研究[11]。早在上世紀(jì)五十年代,我國(guó)學(xué)者就發(fā)現(xiàn)東方田鼠具有天然的對(duì)日本血吸蟲不感染的特性[12-14],近些年來,由于研究其對(duì)血吸蟲天然不感染特性的需要,我們對(duì)東方田鼠進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究,在實(shí)驗(yàn)室繁育過程中,我們發(fā)現(xiàn)東方田鼠在實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)下具有易發(fā)生脂肪肝的傾向[15]。我們推測(cè)東方田鼠有可能作為脂肪肝的研究模型,具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

由于目前對(duì)東方田鼠的研究還不夠深入,已知的與東方田鼠相關(guān)基因序列信息非常少,無法開展對(duì)東方田鼠非酒精性脂肪肝發(fā)病機(jī)制的研究,所以需要建立cDNA文庫(kù),在此基礎(chǔ)上有目的地篩選與非酒精性脂肪肝相關(guān)的克隆進(jìn)行序列測(cè)定,以便獲得東方田鼠基因表達(dá)信息,為進(jìn)一步探討東方田鼠脂肪肝的發(fā)病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。本文在S MART技術(shù)的基礎(chǔ)上采用LD-PCR(長(zhǎng)距離PCR)法構(gòu)建的東方田鼠肝臟cDNA文庫(kù),該方法是基于PCR基礎(chǔ)上的一種cDNA合成的文庫(kù)構(gòu)建方法,其特點(diǎn)是用少量總RNA經(jīng)15～25輪LD-PCR(long distance PCR)擴(kuò)增即獲得幾微克的全長(zhǎng)雙鏈cDNA,同時(shí)保持了原始信息,該技術(shù)產(chǎn)生的雙鏈cDNA富含m RNA完整的5’非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR),也省略了合成接頭的連接、甲基化等操作步驟,降低了實(shí)驗(yàn)過程中的錯(cuò)誤摻入率,更易獲得全長(zhǎng)基因[16]。本實(shí)驗(yàn)建立的東方田鼠肝臟cDNA文庫(kù)經(jīng)檢測(cè)庫(kù)容量為1.08×106,滴度為1076 p fu/μL,重組率約94%,基因的完整性比率為77.3%,所建文庫(kù)質(zhì)量較好,基因的完整性也比較高。

＊和○分別表示相同及相似氨基酸圖4 東方田鼠與大小鼠、人類CYP2E1氨基酸序列同源性比較＊and○rep resent the identity and sim ilar am ino acid residues respectivelyF ig.4 Comparison of the deduced am ino acid sequences of CYP2E1 among M icrotus fortis, Ra ttus norveicgus,M us m uscu lus and Hom o sapiens

＊和○分別表示相同及相似氨基酸圖5 東方田鼠與大小鼠、人類ECHS1氨基酸序列同源性比較＊and○rep resent the identity and sim ilar am ino acid residues,respectivelyF ig.5 Comparison of the deduced am ino acid sequences of ECHS1 among M icro tus fortis,Ra ttus norveicgus,M us m uscu lus and Hom o sapiens

從文庫(kù)篩選目的基因傳統(tǒng)的方法為菌落原位雜交,然后通過特異性標(biāo)記顯色從文庫(kù)中篩選出目的克隆,但上述方法存在篩庫(kù)信息流量較小,工作量大、周期長(zhǎng),費(fèi)用高等缺點(diǎn),而PCR篩選方法利用了PCR反應(yīng)快速、靈敏的特點(diǎn),使篩選時(shí)間大大縮短,篩選的準(zhǔn)確性明顯提高[17]。因此本文在所建cDNA文庫(kù)質(zhì)量較高的基礎(chǔ)上,采用基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物,通過兩輪PCR篩選,得到含有目的片段的載體菌克隆,用質(zhì)粒pB luescrip t II SK通用引物M 13R對(duì)出現(xiàn)目的條帶的菌液進(jìn)行測(cè)序,獲得了東方田鼠與脂肪肝相關(guān)的CYP2E1、CYP2D 5、ECHS1三個(gè)基因的全長(zhǎng)序列。

測(cè)序結(jié)果顯示CYP2E1基因全長(zhǎng)為1685bp,編碼區(qū)長(zhǎng)度為1482bp;CYP2D 5基因全長(zhǎng)1690bp,編碼區(qū)長(zhǎng)度為1514bp;ECHS1基因全長(zhǎng)為1013 bp,編碼區(qū)長(zhǎng)度為873 bp,并可從各自的基因序列上找到起始密碼子ATG、統(tǒng)一閱讀框、終止密碼子TGA、終止密碼子TAA、其下游有加尾信號(hào)及po lyA尾,三個(gè)基因均有完整的開放閱讀框(ORE)。將序列與在NCB I網(wǎng)站中收集的人類、大鼠、小鼠該基因的cDNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行比對(duì),顯示東方田鼠這三個(gè)基因與人類和大小鼠的同源性很高,mRNA的同源性在80%～91%之間,氨基酸的同源性在85%～97%之間。在對(duì)人及大小鼠CYP2E1、CYP2D 5和ECHS1的研究中發(fā)現(xiàn),它們與肝臟的脂肪代謝中起著重要作用,但是這幾個(gè)基因在東方田鼠肝臟脂肪代謝中所起的作用需要進(jìn)一步研究。

本文構(gòu)建的cDNA文庫(kù)及獲得的CYP2E1、CYP2D 5和ECHS1三個(gè)全長(zhǎng)基因?qū)窈箝_展東方田鼠脂肪肝模型和脂肪肝的機(jī)理研究等奠定了基礎(chǔ)。

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A cqu isition and Ana lysis of Three cDNA Fu ll-L ength Sequences from the L iver of M ic ro tus fo rtis

YANG Yu-qin1,FENG Jie2,3,WANG Xue-bin4,X IE Jian-yun2,3,GAO Cheng2,HU Jian-hua2
(1.Fudan University,Shanghai 200032,China;2.ShanghaiQualityM onitoring Center of Laboratory Anim als, ShanghaiLaboratory Animal Research Center,Shanghai 201203;3.Shanghai Institute of Planned Parenthood Research,Shanghai 200032;4.Co llege of Anim al Science and Techno logy,Yangzhou University,Yangzhou 225009)

O b jective To obtain the full-length cDNA sequences of CYP2E1,CYP2D5,ECHS1,which may be related w ith non-alcoholic fatty liver disease,from M icrotus fortis.M ethods To construct M icrotus fortis liver cDNA p lasm id library using S MART technique,to get the purposed co lonies through screening libraries by PCR,and to obtain their fu ll-length cDNA sequences by sequencingw ith pB luescrip t II SK universalp rim ersM 13R.ResultsTh ree full-length cDNA sequences of M icro tus fortis,CYP2E1,CYP2D 5 and ECHS1 were obtained.The CYP2E1 cDNA was 1685 bp in length and contained a 1482 bp open reading fram e(ORF)encoding a 494 am ino acids.The CYP2D 5 cDNA was 1690 bp in length,and contained a 1514 bp ORF encoding 504 am ino acids.The ECHS1 cDNA was 1013 bp in length,and containsed an 873 bp ORF encoding 290 am ino acids.Sequence analysis revealed that the identity of the three cDNA sequences and deduced am ino acids among M icro tus fortis,Hom o sapiens,M us m uscu lus and Ra ttus norvegicus was high. Conc lusion The full-length cDNA sequences of CYP2E1,CYP2D 5,ECHS1 were obtained from M icrotus fortis liver cDNA library,and the gene sequences have been deposited in GenBank(GQ507485,GQ507486,GQ845171),which m ay lay the foundation for researchies of pathogenesis of non-alcoho lic fatty liver disease in M icrotus fortis models.

M icrotus fortis;cDNA sequence;Non-alcoho lic fatty liver d isease

Q781

A

1005-4847(2010)01-0037-07

2009-09-17

上海市科學(xué)基因資助項(xiàng)目(編號(hào):071409001)。

楊玉琴(1980-)女,河北保定人,碩士生,研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。

謝建云(1968-)女,研究員,主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳學(xué)研究。E-mail:xiejianyun@hotmail.com。高誠(chéng)(1961-)男,研究員,研究生導(dǎo)師,E-mail:gaochengdgb@126.com