吳金生,董愛萍,王曉萃,魏志新,劉偉光,欒志敏,祝增軍

(1.山東濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科,山東濰坊 261053;2.濰坊藍(lán)天醫(yī)院,山東濰坊 261042; 3.濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,山東濰坊 261053;4.濰坊醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,山東濰坊 261053)

研究報(bào)告

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)大鼠半橫斷脊髓損傷

吳金生1,董愛萍2,王曉萃3,魏志新4,劉偉光1,欒志敏1,祝增軍1

(1.山東濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科,山東濰坊 261053;2.濰坊藍(lán)天醫(yī)院,山東濰坊 261042; 3.濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,山東濰坊 261053;4.濰坊醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,山東濰坊 261053)

目的 初步探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞,及其移植對(duì)大鼠脊髓半橫斷損傷神經(jīng)功能恢復(fù)和運(yùn)動(dòng)的影響。方法貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(m esenchym al stem cells,M SCs),大鼠脊髓勻漿上清誘導(dǎo)第3代向神經(jīng)細(xì)胞分化,經(jīng)免疫組化鑒定分化后細(xì)胞的性質(zhì)。制備大鼠半橫斷脊髓損傷模型,脊髓損傷局部注射B rdU標(biāo)記誘導(dǎo)后的神經(jīng)細(xì)胞。細(xì)胞移植5周后觀察移植細(xì)胞在脊髓內(nèi)存活分布情況。結(jié)果倒置顯微鏡下可見M SCs呈紡錘形和多角形,有1～2個(gè)核仁,經(jīng)脊髓勻漿上清誘導(dǎo)后,發(fā)出數(shù)個(gè)細(xì)長(zhǎng)突起,并交織成網(wǎng),誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)Nestin,可推測(cè)誘導(dǎo)后的細(xì)胞為M SCs源神經(jīng)細(xì)胞。5周后移植的M SCs在宿主損傷脊髓內(nèi)聚集并存活,表達(dá)MAP-2、NF、GFAP與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大鼠運(yùn)動(dòng)功能較移植前有所改善。結(jié)論M SCs經(jīng)脊髓勻漿上清誘導(dǎo)后移植治療大鼠半橫斷脊髓損傷可使運(yùn)動(dòng)功能得到改善。

間充質(zhì)干細(xì)胞;脊髓損傷;誘導(dǎo)分化;細(xì)胞移植;大鼠

脊髓損傷(sp inal cord in jury,SC I)是常見的嚴(yán)重創(chuàng)傷,脊髓損傷發(fā)生后,損傷部位的神經(jīng)軸突被撕裂,神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞死亡,幸存的軸突發(fā)生脫髓鞘改變,這些最終導(dǎo)致脊髓喪失傳導(dǎo)下行的運(yùn)動(dòng)沖動(dòng)和上行的感覺沖動(dòng)的能力,患者發(fā)生癱瘓。長(zhǎng)期以來(lái),SC I的治療一直是一個(gè)難題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(m esenchym al stem cells,M SCs)是另外一種多功能干細(xì)胞,具有多潛能性,M SCs不僅可分化為中胚層的骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞,而且能分化成外胚層的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)胚層的肝細(xì)胞[1-3]。因此利用M SCs的橫向分化潛能,根據(jù)需要將其誘導(dǎo)分化為特定的組織細(xì)胞,用以修復(fù)受損的組織或器官。脊髓損傷、多發(fā)硬化癥、帕金森病和阿爾茨莫病都是可以用M SCs代替破壞或者無(wú)功能的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行治療的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,因此用干細(xì)胞替換組織或細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾患逐漸成為研究的主要焦點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要?jiǎng)游?、儀器及試劑

健康Sp rague-Daw ley(SD)大鼠,體質(zhì)量200～220 g,雌雄不拘,軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院【SCXK(軍)2002-001】。Thermo CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)),倒置相差顯微鏡(日本O lympus),激光共聚焦顯微鏡(LS M 5 Pascal)德國(guó)Zeiss公司,S W-CT-1FD超凈工作臺(tái)(中國(guó)), Labofuge-300低速離心機(jī)(德國(guó)),L-DM EM(美國(guó)Gibco),胎牛血清(杭州四季青生物有限公司),胰蛋白酶(美國(guó)Sigm a),nestin、MAP-2(兔抗大鼠微管相關(guān)蛋白,北京中杉生物技術(shù)公司),NF(兔抗大鼠神經(jīng)絲蛋白,福建邁新生物技術(shù)公司公司)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP,北京中杉生物技術(shù)公司),B rdU (美國(guó)Sigm a公司),兔抗鼠B rdU二抗(北京中杉生物技術(shù)公司),羊抗兔TR ITC(北京中杉生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓M SCs的分離、培養(yǎng)和傳代[4]:健康SD大鼠,頸椎脫臼處死,無(wú)菌條件下完整取出胸椎-腰椎節(jié)段脊髓,立即用4℃預(yù)冷PBS洗去血跡,置于5 mL 4℃PBS液中進(jìn)行勻漿、離心(2 000 r/m in,10 m in),取上清液先用200目網(wǎng)篩過(guò)濾,再用0.2μm的針頭濾器過(guò)濾,-20℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脊髓勻漿誘導(dǎo)后細(xì)胞免疫組化鑒定:覆有誘導(dǎo)細(xì)胞的蓋玻片用0.01 mol/L PBS洗滌3次,后用4%中性甲醛固定30 m in,PBS洗滌,過(guò)氧化物酶阻斷,非免疫動(dòng)物血清孵育30 m in,加NSE、NF抗體,4℃過(guò)夜,加入生物素標(biāo)記的第二抗體,鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶溶液,DAB溶液顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封固,在顯微鏡下觀察。細(xì)胞免疫組化染色后光鏡下隨機(jī)數(shù)取10個(gè)非重疊視野(×100),計(jì)算nestin、NF陽(yáng)性細(xì)胞分別占總細(xì)胞數(shù)的比例。

1.2.3 脊髓損傷動(dòng)物模型的建立:水合氯醛(30 m g/kg)腹腔注射麻醉,以TS棘突為中心取背部后正中切口長(zhǎng)約5 cm,顯露T7-T11棘突及椎板。咬除T9棘突及全椎板,11號(hào)尖刀片在左側(cè)造成脊髓半橫斷模型。術(shù)后縫合。圖1、2(彩插7)。

1.2.4 細(xì)胞移植及組織學(xué)觀察:M SCs移植組使用微量注射器約45度斜角(針頭斜面向下)將經(jīng)B rdU標(biāo)記的M SCs細(xì)胞懸液緩慢注入到脊髓半切頭側(cè)和尾側(cè)損傷臨近區(qū)域的灰白質(zhì)交界處(距脊髓表面約0.7 mm),總細(xì)胞數(shù)6×105細(xì)胞,注射時(shí)間10 m in,留針5 m in,醫(yī)用生物蛋白膠封閉注射孔。對(duì)照組依同樣方法注射等量PBS緩沖液。手術(shù)或細(xì)胞移植后72 h、7 d、5周灌注固定觀察移植后細(xì)胞存活情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨髓M SC s的形態(tài)特點(diǎn)

采用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠骨髓M SCs。培養(yǎng)24 h,部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),隨后有微小突伸出,懸浮于培養(yǎng)液中的紅細(xì)胞隨換液減少。培養(yǎng)7 d后,細(xì)胞不斷分裂增殖,形成明顯的細(xì)胞集落。培養(yǎng)10～14 d,細(xì)胞貼滿瓶底,呈梭形,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。傳代后的細(xì)胞24 h即貼壁、伸展為三角形、多角形,并逐漸變成短梭形、長(zhǎng)梭形,胞質(zhì)豐富,細(xì)胞核圓形,體積較大,可見到明顯的核仁(圖3A)。

2.2 大鼠脊髓勻漿上清液誘導(dǎo)后細(xì)胞的形態(tài)變化

誘導(dǎo)24 h,細(xì)胞形態(tài)逐漸變成細(xì)長(zhǎng)梭形,排列規(guī)則。48 h細(xì)胞形態(tài)逐漸出現(xiàn)改變,胞體折光性強(qiáng),相互交織,類似神經(jīng)細(xì)胞樣(圖3B)。對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)則未見明顯變化。經(jīng)脊髓勻漿上清誘導(dǎo)48 h后,大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為nestin陽(yáng)性,胞質(zhì)著紅色熒光,誘導(dǎo)72 h陽(yáng)性表達(dá)加強(qiáng)(圖3C);誘導(dǎo)前細(xì)胞不表達(dá)nestin。

2.3 細(xì)胞移植后激光共聚焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)觀察

M SCs源神經(jīng)細(xì)胞移植后,共聚焦顯微鏡下觀察帶有熒光標(biāo)記的B rdU細(xì)胞散在分布于脊髓內(nèi),細(xì)胞核著紅色,呈圓形、橢圓形(圖3D)。移植后脊髓免疫組織化學(xué)染色:MAP-2陽(yáng)性反應(yīng)定位于神經(jīng)元的胞質(zhì),呈棕黃色(圖3E),移植后NF神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒高表達(dá)(圖3F),GFAP表達(dá)陽(yáng)性,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)陽(yáng)性著色(圖3G)與移植前陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)對(duì)比差異有顯著性(P<0.05)。見表1。

表1 術(shù)后5周各組切片M ap-2、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變化(±s,n=6)Tab.1 Changes ofM ap-2-and GFAP-positive cells at 5 weeks after treatm ent.(±s,n=6)

表1 術(shù)后5周各組切片M ap-2、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變化(±s,n=6)Tab.1 Changes ofM ap-2-and GFAP-positive cells at 5 weeks after treatm ent.(±s,n=6)

注:各組間均有差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05Note:There are significant differences among the group s,P<0.05

組別Group MAP-2 GFAP對(duì)照組Control 16.3±4.5 17.5±3.0模型組Model 30.2±5.5 37.6±4.8 MSCs移植組61.2±3.5 65.9±3.63 Transp lantation

2.4 大鼠脊髓損傷行為學(xué)觀察

大鼠在術(shù)后8 h完全清醒,所有受試鼠均出現(xiàn)脊髓休克綜合征,采用BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),術(shù)后3～4 d活動(dòng)減少,飲食減少,尿儲(chǔ)留。細(xì)胞移植術(shù)3～4 d,飲食增加,活動(dòng)增加,整個(gè)肌張力恢復(fù)過(guò)程:1～4 d遲緩性癱,雙后肢拖行,5～8 d痙攣性癱;8～12 d雙下肢恢復(fù)少量活動(dòng);12～16 d雙后肢活動(dòng)逐漸恢復(fù)(表2)。

表2 M SCs移植術(shù)后各組大鼠行為評(píng)分(±s)Tab.2 The behavio ral scores after transp lantation in the rats of various groups.(±s)

表2 M SCs移植術(shù)后各組大鼠行為評(píng)分(±s)Tab.2 The behavio ral scores after transp lantation in the rats of various groups.(±s)

注:移植后與移植前行為學(xué)差異有顯著性,P<0.05Note:There were significant differences in the rat behavior before and after transp lantation.P<0.05

組別Group術(shù)后1 d 1 day after trasp lantation術(shù)后7 d 7 days after transp lan -tation術(shù)后14 d 14 days after transp lantation模型對(duì)照組Contro lmodel 2.44±2.40 5.13±3.36 9.13±4.55 M SCs移植組Transp lantation 2.50±2.67 10.71±6.24 15.00±6.60

2.5 超微結(jié)構(gòu)觀察

電鏡觀察移植前后組織超微結(jié)構(gòu)的變化:移植前脊髓灰質(zhì)大部分神經(jīng)元壞死,胞膜不完整,胞質(zhì)內(nèi)部分細(xì)胞器崩解,白質(zhì)內(nèi),軸索萎縮,水腫,壞死,髓鞘增厚或脫髓現(xiàn)象(圖3H);移植后脊髓灰質(zhì)部分神經(jīng)元壞死,核內(nèi)染色質(zhì)溶解胞膜不完整,部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)尚可,胞質(zhì)內(nèi)線粒體發(fā)達(dá),有些區(qū)域可見膠質(zhì)細(xì)胞增生,白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)尚可,軸索結(jié)構(gòu)完整(圖3 I)。圖3見彩插8。

3 討論

3.1 骨髓M SC s向神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化及鑒定

越來(lái)越多的研究結(jié)果表明骨髓M SCs具有多向分化潛能,它不僅可分化為中胚層來(lái)源的細(xì)胞,而且具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能[5]。W oodbury等[3]用BM E、DM SO和丁羥基茴香醚(BHA)等具有還原性的物質(zhì)將M SCs誘導(dǎo)成為神經(jīng)元,也有學(xué)者[6]采用表皮生長(zhǎng)因子(EGF)或腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)與視黃酸的組合。聯(lián)合應(yīng)用異丁甲基黃嘌呤( IBMX)和二丁基環(huán)磷酸腺苷(dbcAM P)提高細(xì)胞內(nèi)cAM P的含量,亦可將M SCs轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣細(xì)胞[7]。有報(bào)道將M SCs與海馬腦片共同培養(yǎng)后, M SCs可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,表明在這兩種細(xì)胞共培養(yǎng)的過(guò)程中神經(jīng)元可以提供給M SCs分化所必需的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子,此外,細(xì)胞間的相互接觸在M SCs向神經(jīng)元的分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[8]。我們?cè)谝酝膶?shí)驗(yàn)中采用腦勻漿上清作為誘導(dǎo)劑將M SCS誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞取得了很好的效果[4]。為了更好地模擬M SCs在脊髓的生長(zhǎng)分化情況,本實(shí)驗(yàn)采用脊髓勻漿上清液作為生物性誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)M SCs向神經(jīng)元的分化,誘導(dǎo)后的細(xì)胞均表達(dá)神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物NSE和nestin,不表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP,且均具有神經(jīng)元的特有結(jié)構(gòu)—尼氏體,由此證明此方法均可將大鼠骨髓M SCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元而不是星形膠質(zhì)細(xì)胞。

3.2 脊髓損傷動(dòng)物的細(xì)胞移植療法

Harvey等[9]研究認(rèn)為M SCs移植支持SC I后血管神經(jīng)再生和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建。M SCs細(xì)胞移植的方法很多,李進(jìn)領(lǐng)等[10]觀察M SCS通過(guò)靜脈與腹腔不同移植方法對(duì)脊髓損傷修復(fù),細(xì)胞遷移途徑進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)靜脈移植優(yōu)于腹腔移植,尾靜脈注射的M SCs在損傷部位較未損傷部位明顯增多。馮大雄等[11]研究發(fā)現(xiàn),脊髓損傷后靜脈注射M SCs 2、3、6周后,在損傷灶及其鄰近的損傷帶中可檢測(cè)到存活的M SCs,表明M SCs可通過(guò)血腦屏障,在脊髓內(nèi)未見新生腫瘤的形成。A kiyam a等[12]將M SCs直接注射入SC I模型鼠脊髓后發(fā)現(xiàn)在再損傷的中心有明顯的髓鞘再生現(xiàn)象,損傷的邊緣也有部分髓鞘再生現(xiàn)象。骨質(zhì)疏松是SC I的常見并發(fā)癥。李穎智等[13]研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷大鼠易發(fā)生骨質(zhì)疏松癥,損傷平面上下骨質(zhì)均受累,骨質(zhì)疏松后骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變顯著,但不同部位改變程度不同,以損傷平面以下骨質(zhì)受累較重。因此要及時(shí)治療脊髓損傷防止并發(fā)癥的發(fā)生。我們的實(shí)驗(yàn)中直接將誘導(dǎo)標(biāo)記后的細(xì)胞移植入脊髓損傷處,這樣既不能造成細(xì)胞的流失也增加損傷處的細(xì)胞量,移植后脊髓損傷動(dòng)物在組織學(xué)和行為學(xué)的層次都有明顯改善。對(duì)移植前后大鼠脊髓超微結(jié)構(gòu)觀察可見移植前脊髓灰質(zhì)大部分神經(jīng)元壞死,胞膜不完整,胞質(zhì)內(nèi)部分細(xì)胞器崩解,白質(zhì)內(nèi),軸索萎縮,水腫,壞死,髓鞘增厚或脫髓現(xiàn)象;移植后脊髓灰質(zhì)部分神經(jīng)元壞死,核內(nèi)染色質(zhì)溶解胞膜不完整,部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)尚可,胞質(zhì)內(nèi)線粒體發(fā)達(dá),有些區(qū)域可見膠質(zhì)細(xì)胞增生,白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)尚可,軸索結(jié)構(gòu)完整。脊髓損傷鼠在細(xì)胞移植術(shù)后3～4 d,飲食增加,活動(dòng)增加,整個(gè)肌張力恢復(fù)過(guò)程:1～4 d遲緩性癱,雙后肢拖行,5～8 d痙攣性癱;8～12 d雙下肢恢復(fù)少量活動(dòng);12～16 d雙后肢活動(dòng)逐漸恢復(fù)。通過(guò)免疫組織化學(xué)和行為學(xué)觀察,表明M SCs細(xì)胞移植后能夠在脊髓內(nèi)存活,而且脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能有所改善。

目前,在細(xì)胞移植治療SC I的領(lǐng)域中還有許多問(wèn)題亟待解決:①如何引導(dǎo)軸突向合適的目標(biāo)方向生長(zhǎng),進(jìn)而建立功能聯(lián)系的機(jī)制還不清楚。②如果缺乏充足的營(yíng)養(yǎng),M SCs在移植部位壽命有限。③即使是自體移植的M SCs在分離培養(yǎng)擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致分泌細(xì)胞因子及合成表面受體能力下降,從而失去趨化、支持、營(yíng)養(yǎng)等功能,甚至失去干細(xì)胞特性。隨著基礎(chǔ)研究、臨床實(shí)驗(yàn)成果和經(jīng)驗(yàn)的不斷積累,M SCs極有可能在脊髓損傷治療這一世界難題中發(fā)揮不可替代的作用。

(本文圖1,2見彩插7,圖3見彩插8)。

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Bone M arrow M esenchym a l Stem Cell Tran sp lan ta tion in the Repa ir of Ra t Sp ina l Cord Hem isection In jury

WU Jin-sheng1,DONGA i-p ing2,WANG X iao-cui3,W EI Zhi-xin4,L IU W ei-guang1,LUAN Zhi-m in1,ZHU Zeng-jun1
(1.Departm ent ofU ro logy,A ffiliated Hosp ital ofW eifangM edical Co llegeW eifang 261053,China; 2.Lantian Hosp ital,W eifang 261042;3.Departm ent of Hum an Anatom y; 4.Labo ratory ofMorpho logy,W eifangM edical Co llege,W eifang 261053)

O b jective To investigate the differentiation of bone m arrow-derived m esenchym al stem cells into neurons and transp lantation of the stem cells to repair rat hem isection sp inal co rd in jury.M ethods Adherent cu lture was used to isolate and cu lture rat bone m arrow m esenchym al stem cells(M SCs).The rat sp inal cord homogenate supernatant was used to induce neural differentiation of the 3 rd generation cells.The nature of cell differentiation w as identified by imm unohistochem istry.The ratmodel of hem isection sp inal co rd in ju rywas p repared and B rdU was locally in jected to label the induced neurons.The distribution of living cells in the in juried sp inal cord was observed at 5 weeks after cell transp lantation.ResultsM SCswere sp ind le and po lygonal,w ith 1-2 nucleo li seen under the inverted m icroscope.A fter induction w ith sp inal cord homogenate supernatant there were a num ber of slender cytop lasm ic p ro jections form ing inter w ined netwo rk and show ing nestin exp ression,therefo re,indicating the neuronal nature.M SCs at 5 weeks after transp lantation into the sp inal cord in jurywere surviving and their exp ression ofMAP-2,NF,GFAPwas significantly higher than that in the control rats(P<0.05).The ratmotor function was imp roved than before transp lantation.Conc lusion M SCs induced by sp inal cord homogenate supernatant can be transp lanted into hem isection sp inal cord in jury and imp rove the motor function of the in juries lesions.

Bone m arrow;M esenchym al stem cells;Sp inal co rd inju ry;Induced differen tiation;Cell transp lantation;Rat

R651.2

A

1005-4847(2010)01-0056-04

2009-04-13

山東省濰坊市科學(xué)技術(shù)局資助項(xiàng)目(編號(hào):200703035)。

吳金生,男,主治醫(yī)師,碩士學(xué)位.研究方向:干細(xì)胞誘導(dǎo)分化及移植。E-mail:w js w fm c@163.com