唐小瑩,潘春武,孫俊,黃蔚,王華楓,沈周俊

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院,上海 200025)

研究報告

大鼠原位膀胱癌模型的建立與CT診斷價值

唐小瑩,潘春武,孫俊,黃蔚,王華楓,沈周俊

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院,上海 200025)

目的 研究N-甲基亞硝基脲誘導(dǎo)大鼠原位膀胱癌模型的構(gòu)建過程以及計算機斷層掃描對大鼠原位膀胱癌的診斷價值。方法50只SD大鼠隨機分為兩組,對照組A組15只,實驗組B組35只。B組大鼠經(jīng)尿道膀胱內(nèi)灌注MNU每兩周一次,每次2 m g,共4次。A組大鼠用生理鹽水以同樣的方法灌注。于第14周末對兩組大鼠進行膀胱CT掃描診斷,并且處死后取膀胱組織行病理學(xué)觀察。結(jié)果B組28只大鼠CT掃描膀胱均見明顯異常,表現(xiàn)為局部腫塊突起或膀胱壁不規(guī)則增厚、密度不均,病理診斷均為膀胱癌。A組13只大鼠經(jīng)CT掃描未發(fā)現(xiàn)膀胱腫瘤,病理檢查未見腫瘤組織。結(jié)論MNU可以誘導(dǎo)大鼠原位膀胱癌模型的建立。CT掃描可作為大鼠原位膀胱癌診斷的可靠方法,并能為腫瘤的化療或放療等后續(xù)實驗提供更好的大鼠模型。

MNU;原位膀胱癌;CT診斷

膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)中最高發(fā)的腫瘤,構(gòu)建膀胱癌動物模型對于研究人類膀胱癌有著重要的意義。N-甲基亞硝基脲(N-m ethyl-nitrosourea,MNU)作為化學(xué)致癌劑用于建立原位膀胱癌動物模型雖然在國內(nèi)外已有研究和報道[1],但是模型建立后通常是應(yīng)用處死后的病理學(xué)診斷來判斷模型是否成功建立,從而無法對建模后的動物進一步行體內(nèi)實驗研究。因此我們應(yīng)用CT(computed tomography)這種無需處死動物的檢查方法來對動物模型的建立及后續(xù)實驗進行評判與指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與主要試劑

MNU(規(guī)格為每瓶1g),美國Sigm a公司產(chǎn)品,用避光玻璃瓶分裝為每瓶200 m g,置于-4℃冰箱封存。枸櫞酸緩沖液的配置:枸櫞酸4.2 g,氫氧化鈉2.1 g,加去離子240 mL水振搖使之溶解,用5mol/L濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.0,再加去離子水至250 mL,搖勻即可。

1.2 實驗動物及分組

選用10周齡～12周齡SPF級雌性SD大鼠50只,體質(zhì)量(200±10)g,由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物科學(xué)部提供【SCXK(滬)2004-0001】,插管操作過程在屏障動物實驗室進行【SYXK(滬)2008-0050】。實驗大鼠用耳朵打孔標(biāo)記法標(biāo)記,隨機分為兩組,A組15只(對照組),B組35只(實驗組)。飼養(yǎng)條件:SPF級動物實驗室,常規(guī)飲食,12 h晝夜節(jié)律,濕度50%～60%,溫度24～26℃。實驗過程中按照實驗動物3R原則對大鼠給予人道的關(guān)懷。

1.3 實驗方法

1.3.1 MNU溶液的配置:實驗前取一瓶分裝的MNU,用臨時配置的pH 6.0濃度為0.1 mmol/L的枸櫞酸緩沖液10 mL將MNU溶解,此時MNU濃度為20 m g/mL,膀胱灌注每只大鼠用量為0.1 mL。

1.3.2 MNU膀胱灌注:2%戊巴比妥腹腔麻醉(50 mg/ kg)生效后仰臥固定,0.1%新潔爾滅溶液消毒外陰部,用長約6 cm的自制導(dǎo)尿管從尿道外口插入膀胱,抽出尿液后,A組每只注射生理鹽水0.1 mL,B組每只注入MNU溶液0.1 mL。每兩周灌注一次,共4次。

1.4 CT掃描

CT掃描用美國GE公司light speed 16層螺旋CT機,掃描層厚1.25 mm。于實驗第14周末,麻醉大鼠后置入導(dǎo)尿管用生理鹽水充盈膀胱,隨后進行腹部CT掃描,觀察掃描圖像。A、B兩組所有大鼠都進行腹部CT掃描。

1.5 標(biāo)本制備

于第14周末CT掃描后處死所有大鼠,觀察膀胱、腎臟等有無病變,取出新鮮的膀胱組織浸于10%甲醛中固定24 h,常規(guī)石蠟包埋,切片4～5 μm,HE染色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

通過平行組對照設(shè)計分析,比較兩組樣本誘癌率,采用χ2檢驗,P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

大鼠一般于麻醉后2h左右開始蘇醒,4h能夠恢復(fù)活動。實驗過程中A組大鼠死亡2只,B組大鼠死亡7只,其中B組有三只大鼠在第14周初死亡。整個實驗中大鼠死亡9只,尸解發(fā)現(xiàn)其中因腫瘤晚期惡液質(zhì)死亡的有3只,因麻醉后壓迫窒息死亡的有3只、因尿路嚴(yán)重化膿性感染致死的有2只、因麻醉針刺入腸腔致彌漫性腹膜炎致死的有1只。B組中于第14周初死亡的三只大鼠體重明顯減輕,其余大鼠體重增長率與A組接近,活動正常。第14周時B組有8只大鼠出現(xiàn)肉眼血尿。

2.2 病理學(xué)肉眼觀察

A組13只大鼠膀胱黏膜光滑,壁薄,厚度均勻,血管紋理清晰,未見腫塊新生物等,其中一只大鼠出現(xiàn)膀胱內(nèi)結(jié)石,直徑約4 mm。B組31只大鼠(包括第14周初死亡的3只大鼠)膀胱黏膜均出現(xiàn)異常,出現(xiàn)菜花樣腫塊或米粒樣新生物的有15只,局部黏膜不規(guī)則增厚的14只,黏膜出現(xiàn)細顆粒的2只,其中有3只大鼠出現(xiàn)了膀胱或(和)輸尿管結(jié)石(9.7%),7只大鼠出現(xiàn)腎盂或(和)輸尿管積水(22.6%)。

2.3 病理組織學(xué)切片觀察

光鏡結(jié)果:A組所有大鼠膀胱黏膜均為3～4層移行上皮細胞組成,細胞呈扁平狀,大小均一,排列有序,核圓,規(guī)則,黏膜細胞核質(zhì)比1∶4～6,由內(nèi)向外依次為黏膜層、固有層、肌層和漿肌層(圖1A、B)。B組大鼠膀胱黏膜總體表現(xiàn)為黏膜細胞大小不一,移行上皮細胞層數(shù)明顯增多,排列紊亂,極向消失,核大不規(guī)則,核染色質(zhì)為顆粒狀,分布不均勻,核膜增厚,核仁肥大,核質(zhì)比例增大,核分裂像明顯(圖1C、D)。A組8只大鼠和B組17只大鼠膀胱黏膜有中度慢性炎癥。圖1見彩插2。

2.4 CT掃描觀察結(jié)果

A組大鼠膀胱充盈顯示良好,膀胱壁薄,光滑,厚度均一,組織界限顯示清晰(圖2A);B組掃描的28只大鼠膀胱均有不同程度影響學(xué)異常,表現(xiàn)為突起的米粒樣腫塊(圖2B)、隆起的菜花樣腫塊(圖2C)、局部膀胱壁黏膜增厚(圖2D)等。CT掃描對膀胱癌的診斷與其病理診斷完全相符。圖2見彩插2。

2.5 誘發(fā)大鼠原位膀胱癌模型結(jié)果

第14周末:A組大鼠致癌率0/13(0%),死亡率2/15(13.3%);B組實驗組大鼠致癌率31/31 (100%),死亡率7/35(20%)。B組大鼠致癌率與A組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

在膀胱腫瘤動物模型建立方面研究者已經(jīng)找到多種實驗方法,化學(xué)致癌劑誘癌法在建立膀胱原位癌模型方面有著諸多的優(yōu)點[2]:①有較強的膀胱選擇性;②誘癌周期相對短;③誘癌率高,可達100%;④誘發(fā)的腫瘤與人類膀胱癌的組織學(xué)相似;⑤對實驗動物要求低,一般實驗動物均可誘癌。MNU作為一種較多使用的誘導(dǎo)大鼠原位膀胱癌模型的化學(xué)致癌劑,國內(nèi)已有學(xué)者對其研究及應(yīng)用,其誘癌方法簡單,致癌率高,致癌效果明顯[3]。MNU誘導(dǎo)的膀胱癌其形態(tài)學(xué)與病理學(xué)特征和人膀胱癌相似,腫瘤源于黏膜上皮,為移行上皮癌,本實驗病理結(jié)果與劉紅耀等[4]報道基本相符。實驗中未出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移,與楊玉成等研究的結(jié)果相同[5]。因此經(jīng)尿道膀胱灌注MNU法誘導(dǎo)大鼠原位膀胱癌模型方法可行可靠,效果確切。

本實驗中A組大鼠死亡2只(2/15),B組大鼠死亡7只(7/35),兩組大鼠死亡率無統(tǒng)計學(xué)差異(P >0.05),故經(jīng)尿道膀胱灌MNU誘導(dǎo)大鼠原位膀胱癌的方法不會引起大鼠死亡率的明顯增加。但是分析這9只大鼠的死亡原因構(gòu)成會發(fā)現(xiàn),因操作和管理不當(dāng)以及感染所致大鼠死亡的占66.7%(6/9)。麻醉后的大鼠聚集在一起容易發(fā)生窒息,特別是前后麻醉時間間隔相差大的大鼠放在同一籠時更易發(fā)生,反復(fù)進行侵襲性操作也易出現(xiàn)感染,因此加強對實驗大鼠麻醉后的管理與預(yù)防感染能夠降低實驗大鼠的意外死亡率,從而提高研究工作質(zhì)量和降低實驗建模的成本。

大鼠膀胱癌模型建立后,處死大鼠對其膀胱進行病理學(xué)檢查是診斷膀胱癌的金標(biāo)準(zhǔn)。但是建立大鼠膀胱癌模型后通常需要繼續(xù)進行體內(nèi)實驗,因此只能用非處死方法鑒定模型是否成功建立:可以通過解剖觀察后再縫合的方法確認(rèn)致癌效果,但是容易出現(xiàn)感染、腫瘤種植致死等缺點;也可以用AO染色法檢測24h尿脫落細胞,但是陽性率低,假陽性率高;用生物發(fā)光法檢測腫瘤模型[6],雖然診斷率較高,但是不能直觀地了解腫瘤的大小和形狀;甚至MR I也可以檢測大鼠膀胱腫瘤,但是費用比較高。然而用CT掃描的方法來鑒定動物腫瘤模型在國內(nèi)尚不多見。本實驗通過CT掃描來鑒定大鼠原位膀胱癌模型,其速度快,定位準(zhǔn)確,顯示直觀清楚,大小可測量,平掃無創(chuàng)傷,診斷結(jié)果與病理診斷完全相符,診斷率達100%。盡管臨床上CT難以發(fā)現(xiàn)早期局限于膀胱壁內(nèi)的小于10 mm的腫塊[7],但是因掃描層厚及對象不同,本實驗中通過與病理結(jié)果對照發(fā)現(xiàn)CT掃描能夠清楚顯示出膀胱壁上直徑大于2 mm的顆粒樣腫塊。因此,通過CT掃描診斷大鼠原位膀胱癌的方法相比而言更加靈敏、準(zhǔn)確、直接、方便。

反復(fù)經(jīng)尿道插管膀胱灌注易使大鼠出現(xiàn)尿道、膀胱或輸尿管結(jié)石,甚至出現(xiàn)重度輸尿管腎盂積水,這是經(jīng)尿道灌注MNU誘導(dǎo)膀胱癌的缺點[8],但是本實驗中可以通過CT檢查將其篩選,從而可以剔除那些巨大結(jié)石或結(jié)石梗阻引起的腎盂輸尿管積水等不利于進一步研究的腫瘤模型。另外在膀胱癌動物模型的治療前后可以觀察CT圖像中腫瘤的范圍、大小等變化來評價治療效果。因此在動物腫瘤模型建立與治療的實驗中可以通過CT掃描的方法來獲取相關(guān)的資料與數(shù)據(jù),并能為進一步動物模型的實驗研究提供便利。

(本文圖1、2見彩插2。)

[1] Yam an O,Ozdiler E,Sozen S,et al.Trans m u rally absorbed intravesical chemotherapy w ith dimethylsulfoxide in an animal model[J].Int J U ro l,1999,6:87-92.

[2] Chen T,Na Y,W anibuchi H,et al.Loss of heterozygosity in (Lew is F344)F1 rat u rinary b ladder tumors induced w ith N-buty l-N-(4-hyd roxybuty1)nitrosam ine fo llow ed by dimethylarsinic acid or sodium L-ascorbate[J].Jpn J Cancer Res,1999,90(8):818-823.

[3] 丁鴻,錢立新.大鼠膀胱癌模型建立的實驗研究[J].實驗動物與比較醫(yī)學(xué),2007,27(1):32-36.

[4] 劉紅耀,李曉東,米振國,等.N2甲基亞硝基脲的制備及其誘發(fā)膀胱腫瘤的作用[J].中華實驗外科雜志,2000,17:548-549.

[5] 楊玉成,侯建全,周守軍,等.MNU誘導(dǎo)的大白鼠膀胱腫瘤模型的建立及病理學(xué)動態(tài)觀察[J].蘇州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2006,26(1):41-43.

[6] Hadaschik BA,B lack PC,Sea JC,et al.A validated mouse model for orthotop ic b ladder cancer using transu rethral tumo r inocu lation and biolum inescence imaging[J].BJU Int,2007, 100:1377-1384.

[7] 魏巍巍,許維亮,甘潔,等.膀胱癌的CT診斷與分期評價[J ].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2007,35(3):236-237.

[8] 顏汝平,王劍松,徐鴻毅.膀胱癌的動物實驗?zāi)Ｐ蚚J].國外醫(yī)學(xué)泌尿系統(tǒng)分冊,2005,25(4):446-448.

Estab lishm en t and CT D iagnosis of O r thotop ic Ra tM odel of B ladder Cancer

TANG X iao-ying,PAN Chun-wu,SUN Jun,HUANGW ei,WANG Hua-feng,SHEN Zhou-jun
(Rui Jin Hosp ital,Shanghai Jiao TongUniversity Schoo l ofM edicine,Shanghai 200025,China) Corresponding author:SHEN Zhou-jun

O b jective To establish an orthotop ic rat model of bladder cancer induced by N-m ethyl-nitrosourea (MNU)and to evaluate the diagnostic value of CT(computed tomography)scanning in this exper im entalmodel.M ethods 50 SD ratswere random ly divided into the control group(group A)w ith 15 rats and experim ental group(group B)w ith 35 rats.Each rat of group B was treated w ith 2 m g MNU per dose every other week,totally 4 doses,by per urethra adm inistration.M eanw hile,each rat of group A was treated w ith norm al saline.Then,at the 14thweek,all the rats were evaluated by CT scanning and patho logical exam ination.ResultsAbnor m al changeswere detected in each of the 28 rats in group B by CT scanning,and m anifested as local m ass,thickening b ladder w all accompanied w ith heterogeneous density. B ladder cancer was d iagnosed by patho logy.However,no b ladder tumo r was detected by CT scanning and patho logical exam ination in group A.Conc lusion A rat model of orthotop ic bladder cancer can be estab lished by per urethra adm inistration ofMNU.CT scanning is a reliab le diagnostic technique concerning thismodel.Further mo re,this technique can render us a more suitab le rat model fo r further experim ental studies on chemotherapy and radiotherapy of b ladder cancer.

N-m ethyl-nitrosourea(MNU);O rthotop ic b ladder cancer;CT diagnosis;Rat

R737.14

A

1005-4847(2010)01-0006-03

2009-05-25

國家自然科學(xué)基金資助項目(編號:30571862)。

唐小瑩(1980-),男,住院醫(yī)師,碩士研究生,研究方向:膀胱癌與動物模型。

沈周俊,教授,博士生導(dǎo)師,E-mail:shenzj6@sina.com。