李洪濤,肖東,顧為望,吳清洪,袁進(jìn),王萬(wàn)山,張嘉寧

(1.廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,廣州 510120;2.南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,廣州 510515)

研究報(bào)告

西藏小型豬細(xì)胞色素b基因序列的比較

李洪濤1,肖東2,顧為望2,吳清洪2,袁進(jìn)2,王萬(wàn)山2,張嘉寧2

(1.廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,廣州 510120;2.南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,廣州 510515)

目的 對(duì)西藏小型豬Cyt b-基因序列進(jìn)行分析,研究其遺傳背景及其與國(guó)內(nèi)家豬的親緣關(guān)系。方法提取西藏小型豬和巴馬小型豬、貴州香豬、五指山豬的全基因組DNA,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Cyt b基因,測(cè)序后進(jìn)行堿基序列比對(duì),建立親緣關(guān)系樹(shù),分析西藏小型豬的遺傳背景。結(jié)果西藏小型豬等國(guó)內(nèi)部分品種豬的Cyt b基因序列與歐洲豬相比有14個(gè)變異位點(diǎn);但是西藏小型豬與國(guó)內(nèi)品種豬相比存在兩個(gè)特殊堿基位點(diǎn)即在420位點(diǎn)T→C轉(zhuǎn)換的同時(shí)在883位點(diǎn)存在G→A轉(zhuǎn)換。結(jié)論西藏小型豬與巴馬小型豬、貴州香豬、五指山豬等國(guó)內(nèi)家豬有很近的親緣關(guān)系。同時(shí)進(jìn)一步證實(shí)西藏小型豬群體內(nèi)存在一定的遺傳分化。

西藏小型豬;細(xì)胞色素B基因;比較研究

細(xì)胞色素b(Cyt b)基因是m tDNA中重要的蛋白編碼基因,編碼細(xì)胞色素的一個(gè)亞基,它包含種間乃至到科間的進(jìn)化遺傳信息,廣泛用來(lái)進(jìn)行法醫(yī)學(xué)種屬鑒定[1,2]和脊椎動(dòng)物種上和種下分類階元的系統(tǒng)進(jìn)化研究,被認(rèn)為是解決系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題最可信的m tDNA標(biāo)記之一[3]。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)我國(guó)的黃牛品種[4]、綿羊[5]、山羊[6]的Cyt b基因遺傳多態(tài)性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了分析,對(duì)動(dòng)物起源的研究有了更為科學(xué)的推斷。

豬的Cyt b基因堿基序列與人類以及牛、羊等哺乳動(dòng)物一樣全長(zhǎng)為1140 bp,同樣存在著廣泛的多態(tài)性,并按母系遺傳方式傳遞給下一代。在對(duì)西藏小型豬m tDNA控制區(qū)的研究中,根據(jù)m tDNA控制區(qū)串聯(lián)重復(fù)區(qū)的長(zhǎng)度和重復(fù)片段存在異質(zhì)性,將西藏小型豬體分為A型和B型[7]。母系系譜分析顯示,串聯(lián)重復(fù)區(qū)的排列類型同樣由母本傳給后代,與父本沒(méi)有關(guān)系。2004年南方醫(yī)科大學(xué)從西藏自治區(qū)工布江達(dá)縣將50頭藏豬(雌、雄各半)引種到廣州,首次開(kāi)展對(duì)藏豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化的培育,并將其命名為西藏小型豬(Tibet m ini-p ig),2006底獲得廣東省實(shí)驗(yàn)用西藏小型豬生產(chǎn)質(zhì)量合格證。本項(xiàng)研究的目的就是在對(duì)線粒體控制區(qū)研究的基礎(chǔ)上,分析西藏小型豬Cyt b基因的堿基序列,研究西藏小型豬Cyt b基因序列與線粒體控制區(qū)序列的變異是否存在相關(guān)性,以及西藏小型豬的遺傳分化以及與其他小型豬的親緣關(guān)系,對(duì)小型豬新品系的培育具有重要的理論指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供西藏小型豬DNA樣品23份(代表m tDNA D-loop5′端序列的主要單倍型個(gè)體),巴馬小型豬、貴州香豬和五指山豬的DNA樣品[7]。另外從GenBank下載的13種國(guó)內(nèi)外的代表豬的m tDNA Cytb基因堿基序列用于比對(duì)研究。具體品種和GenBank登錄號(hào)為:歐洲豬(AJ002189)、杜洛克(Duroc-AY830186)、JNP1-AY830173、S WB1-AY237510、 IB1-AY237484、漢普夏(Hampshire–AY 830187)、PAuk01 New Zealand-DQ444707、瑞典野豬(Swedish w ild boar-AF304 203)、Landerace-AF486866、大白豬(LW 2-AF136548)、榮昌豬(Rongchang–AF486860)、香豬(X iang-AF486859)及梅山豬(M eishan-AF304200)。

1.2 Cyt b基因序列擴(kuò)增和分析

參照文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)特異引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物:Cyt b gene 14109到15355(forw ard:5′-CACGACCAATGACATGAAAAATC-3′,and reverse:5′-TGGCCC-TCCTT TTCTGGTTTA-3′)。產(chǎn)物擴(kuò)增采用一管便捷式PCR試劑盒:2×Pfu PCR M aste rM ix進(jìn)行目的產(chǎn)物的擴(kuò)增。

反應(yīng)體系50μL,包括DNA模板2μg、P1和P2分別為(10μmol/L)2μL、2×Pfu M aste rM ix 25 μL、ddH2O 19μL。擴(kuò)增程序:預(yù)變性94℃5 m in; 94℃45 s,55℃45 s和72℃1 m in,35循環(huán);72℃延伸7 m in后4℃保存。產(chǎn)物進(jìn)行電泳觀察。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序,結(jié)合C lustalw軟件和M EGA 3.0軟件進(jìn)行所測(cè)序列比對(duì),并經(jīng)人工核查,確定變異位點(diǎn),建立西藏小型豬和國(guó)內(nèi)其他豬的親緣關(guān)系樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 西藏小型豬Cyt b堿基全序列比對(duì)

西藏小型豬和其他三種小型豬Cyt b基因序列擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果,見(jiàn)圖1。以擴(kuò)增用引物作為測(cè)序引物,測(cè)定2個(gè)反應(yīng)結(jié)果,拼接后得到擴(kuò)增片段的全序列大約1247 bp,去掉兩翼的107 bp序列后得到完整的1140 bp Cytb基因序列。西藏小型豬Cyt b序列和其他豬一樣全長(zhǎng)為1140 bp,西藏小型豬Cyt b基因的堿基組成G+C含量為42%,A+T含量為58%;有9個(gè)變異位點(diǎn),核苷酸多樣性為0.078 9。A型和B型西藏小型豬的堿基組成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 西藏小型豬、巴馬小型豬、五指山豬和貴州香豬Cyt b基因瓊脂糖凝膠電泳圖F ig.1 Agarose gel m app ing of Cyt b gene in the m ini-p igs.

2.2 西藏小型豬和國(guó)內(nèi)家豬與歐洲豬Cyt b堿基序列比對(duì)

多序列比對(duì)分析顯示,西藏小型豬與國(guó)內(nèi)家豬的序列變異位點(diǎn)少,與榮昌豬相比,西藏小型豬的Cyt b堿基序列有6種單倍型(T M 01、04、17、28、43、45);巴馬小型豬有3種單倍型(b14、15、16);貴州香豬有1種單倍型(g14);五指山豬有2種單倍型(w zs01、11)。這4種小型豬之間都有共享單倍型。歐洲豬Cyt b堿基序列比較,9個(gè)歐洲品種豬有5個(gè)變異位點(diǎn),而國(guó)內(nèi)家豬與歐洲豬的差異較大,見(jiàn)表1。

表1 西藏小型豬和其他豬Cyt b基因序列比對(duì)Tab.1 Variab le nucleotide sites of Cyt b gene of the four breeds of the m ini-p igs

西藏小型豬有14個(gè)位點(diǎn)與國(guó)內(nèi)家豬相同而與歐洲豬不同,而且全部為轉(zhuǎn)換位點(diǎn),未見(jiàn)顛換或缺失、插入現(xiàn)象。另外與國(guó)內(nèi)家豬相比,在420位點(diǎn)存在T→C轉(zhuǎn)換,同時(shí)在883位點(diǎn)存在G→A轉(zhuǎn)換,見(jiàn)表1。以歐洲豬作外圍以Cyt b序列建立的親緣關(guān)系樹(shù)顯示,國(guó)內(nèi)家豬與歐洲豬完全分開(kāi),如圖2所示,西藏小型豬也被分為兩個(gè)部分。

3 討論

T M、T MP:西藏小型豬;b:巴馬小型豬;g:貴州香豬;wzs:五指山豬。歐洲豬(A 002189J)作為外圍。圖2 西藏小型豬和國(guó)內(nèi)家豬與歐洲豬的親緣關(guān)系樹(shù)Note:T M,T M P:Tibet m ini-p ig;b:Bam a m iniature p ig;g: Guizhou xiang p ig;W uzhishan p ig.European p ig(AJ002189)as outgroup.F ig.2 The phylogenetic tree of the Tibetm ini-p igs, other Chinese p igs and European p igs.

通過(guò)對(duì)西藏小型豬m tDNA控制區(qū)序列研究,根據(jù)串聯(lián)重復(fù)區(qū)10bp的重復(fù)片段及其排列,我們將重復(fù)片段完全一樣的個(gè)體為A型,其余部分的個(gè)體為B型。同時(shí),控制區(qū)(D-loop區(qū))5′端有20個(gè)變異位點(diǎn),包括轉(zhuǎn)換和顛換,其中以三個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)較突出,即305位點(diǎn)t→c轉(zhuǎn)換、500位點(diǎn)a→g轉(zhuǎn)換、691位點(diǎn)a→g轉(zhuǎn)換。A型和B型的變異,與5′端三個(gè)主要變異位點(diǎn)幾乎是相對(duì)應(yīng)的[7]。本實(shí)驗(yàn)主要以代表控制區(qū)5′端序列單倍型的西藏小型豬個(gè)體以及巴馬小型豬、貴州香豬和五指山豬的部分單倍型個(gè)體的基因組DNA,擴(kuò)增Cyt b基因序列與基因庫(kù)中公布的部分國(guó)內(nèi)家豬和歐洲豬序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),國(guó)內(nèi)豬的Cyt b基因序列間的同源性較高;與歐洲豬的差異較大,至少有14個(gè)位點(diǎn)完全不同(轉(zhuǎn)換位點(diǎn))。從血緣關(guān)系樹(shù)也可以看出國(guó)內(nèi)家豬與歐洲豬的血緣關(guān)系較遠(yuǎn),此一結(jié)果與許多文獻(xiàn)結(jié)果一致[9-15]。在所測(cè)的23個(gè)西藏小型豬的序列當(dāng)中,有兩個(gè)特殊位點(diǎn)即在420位點(diǎn)T→C轉(zhuǎn)換(11/23)的同時(shí),在883位點(diǎn)存在G→A轉(zhuǎn)換(12/23),這也是在親緣關(guān)系樹(shù)中相對(duì)分為兩部分的主要因素。說(shuō)明西藏小型豬的Cyt b基因序列也存在分化,由此說(shuō)明線粒體控制區(qū)的分化,包括串聯(lián)重復(fù)區(qū)的排列變化、5′端堿基序列的位點(diǎn)轉(zhuǎn)換可能與Cyt b的分化存在很大相關(guān)性。這些分化變異是否對(duì)動(dòng)物的生理生化指標(biāo)產(chǎn)生影響還需要進(jìn)一步比較研究。

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Com par ison of the Cy t b Gene Sequences in T ibetM in i-Pig and O ther Ch inese Pigs

L IHong-tao1,X IAO Dong2,GU W ei-wang2＊,WU Q ing-hong2, YUAN Jin2,WANGW an-shan2,ZHANG Jia-ning2
(1.FirstA ffiliated Hosp ital of GuangzhouM edicalUniversity,Guangzhou 510120,China;
2.Laboratory Anim al Center,SouthernM edicalUniversity,Guangzhou 510515,China)

O b jective To analyze the Cyt b gene sequences in Tibet m ini-p igs and clarify the differences and genetic relationship w ith other Chinese p igs.M ethod The sequence of Cyt b gene w as amp lified from genome DNA of Tibetm ini-p ig,Bam a m iniature p igs,Guizhou xiang p igs and W uzhishan(W ZS)p igs.A fter sequencing,the base sequences were compared and analysed.The b lood relationship tree and evo lution position of Tibet m ini-p ig were established.Resu lt There were 14 m utation sites between dom estic p igs in China and p igs from Europe.Besides there was a significant difference in two nuc leo tide site:a T→C sw itch in site 420 and the G→A s w itch in site 883 at the sam e tim e.Conc lusion Chinese p igs include Bam a m iniature p igs,Guizhou xiang p igs andW ZS p igs,have a very close b lood relationship w ith som e of Tibetm ini-p igs.It has been confirm ed that there is a certain genetic d ifferentiation in the Tibet m ini-p ig.

Tibetm ini-p ig;Cyt b gene;Comparative research

R332

A

1005-4847(2010)01-0044-04

2009-06-04

廣東省科研計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):2006B60101059,2007B020706002)。

李洪濤(1964-),男,研究方向:比較醫(yī)學(xué)。E-mail:Hongtao@zzu.edu.cn

顧為望。E-m ail:Guww100@163.com