王岳屏,彭國順,龔五星,石 理

心房顫動(dòng)(AF)具有較高的患病率、致殘率和病死率,住院病例數(shù)隨年齡的增高呈進(jìn)行性遞增趨勢[1-4],高血壓是AF常見病因之一。本文通過研究血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)1型受體(AT1R)基因A1166C多態(tài)性與AF患者相關(guān)關(guān)系以及高血壓并AF不同證候間AT1R基因型頻率及等位基因頻率分布,旨在從分子生物學(xué)水平探討遺傳背景對AF和高血壓并AF不同證候的影響,以期為AF的預(yù)防和治療提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2007年8月—2010年1月住院患者。AF診斷標(biāo)準(zhǔn):體表心電圖表現(xiàn)P波消失,代之以小而不規(guī)則的振幅、形態(tài)均不一致的基線波(房顫波 f),頻率 350/min～600/min,心室律大多不規(guī)則。納入標(biāo)準(zhǔn):符合診斷標(biāo)準(zhǔn);AF持續(xù)時(shí)間≥7 d;年齡大于18歲;知情同意者。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者。

血壓測定、高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)按《中國高血壓防治指南》[5]執(zhí)行,中醫(yī)辨證按《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[6]。本研究高血壓并AF共68例,其中肝火亢盛證17例,陰虛陽亢證11例,痰濕壅盛證34例,陰陽兩虛證6例。因病例數(shù)偏少,為便于統(tǒng)計(jì),將肝火亢盛證、痰濕壅盛證合并為高血壓實(shí)證51例,陰虛陽亢證、陰陽兩虛證合并為高血壓虛證17例。對照組為同期體檢科健康檢查正常者。

1.2 常規(guī)檢查 詢問病史、體格檢查及中醫(yī)望、聞、問、切:記錄血壓、身高、體重,計(jì)算體重指數(shù)(BMI)=體重(kg)/身高(m2)。

1.3 基因型鑒定 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法鑒定AT 1R基因1166位點(diǎn)基因型[7]。基因組DNA的提取,目的片段PCR擴(kuò)增(引物由上海生工公司合成)。PCR反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增參數(shù)(HEMA9600)。產(chǎn)物鑒定:取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ L通過10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳20 min,EB染色,紫外燈下檢測均出現(xiàn)274 bp片斷。酶切,基因型鑒定。

1.4 基因型判斷 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為274bp的片段。如AT1R基因1166位點(diǎn)的堿基A被C替代,則出現(xiàn)一個(gè)限制性酶切位點(diǎn),可被限制性內(nèi)切酶Ddel水解。在紫外燈下鑒定酶切后的電泳帶,如兩等位基因均無酶切位點(diǎn),可見一條274bp的熒光帶,定義為無突變的純合子AA型;如兩等位基因均有酶切位點(diǎn),可產(chǎn)生165bp和109bp兩條帶,定義為有突變的純合子CC型;如僅一個(gè)等位基因含有酶切位點(diǎn),則產(chǎn)生274bp、165bp和109bp三條帶,定義為部分突變的雜合子AC型(見圖1)。

圖1 AT1R基因聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增片段及限制性酶切后片段

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),頻數(shù)間比較采用χ2檢驗(yàn),Logistic回歸分析基因型對房顫的獨(dú)立危險(xiǎn)性。相對風(fēng)險(xiǎn)率以比數(shù)比(OR)及95%置信區(qū)間(CI)表示。

2 結(jié) 果

2.1 房顫組與對照組一般資料比較(見表1)

表1 房顫組與對照組一般資料比較

2.2 基因型及等位基因(見表2) 與AA型相比,AC型+CC型者發(fā)生AF的風(fēng)險(xiǎn)率為 3.657(95%CI為 1.181～11.322)。房顫組C等位基因型頻率與對照組比較:χ2=6.109,P=0.013;風(fēng)險(xiǎn)率 3.702(95%CI為 1.225～11.188)。

表2 房顫組與對照組基因型頻率及等位基因頻率分布 例(%)

2.3 非條件Logistic回歸分析總體AF易患因素 以是否發(fā)生AF為應(yīng)變量,以基因型(X1)、年齡(X2)、BMI(X3)、SBP(X4)、DBP(X5)為自變量,并定義 X1為分類變量,用Enter法建立二值Logistic回歸方程:P=Exp(-6.699+1.419×X1+0.005×X2+0.086×X3+0.046×X4-0.012×X5)/[1+Exp(-6.699+1.419×X1+0.005×X2+0.086×X3+0.046×X4-0.012×X5)]。結(jié)果表明,在本實(shí)驗(yàn)中,基因型、收縮壓參與增加總體 AF發(fā)生的概率(P分別為0.019、0.002)。以AA型為參照,AC型+CC型發(fā)生AF的OR為4.132(95%CI為1.263～13.513)。

2.4 房顫患者基因型頻率及等位基因頻率分布(見表3)

表3 房顫實(shí)證組與虛證組基因型頻率及等位基因頻率分布 例(%)

3 討 論

Goette等[9]研究顯示慢性AF患者心房肌血管緊張素轉(zhuǎn)化酶表達(dá)較竇性心律者增加3倍,Kumagai等[10]報(bào)道,與竇性心律病人相比,慢性房顫病人的心房組織中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶蛋白質(zhì)含量可提高3倍,Li等[11]在心房快速起搏誘發(fā)房顫的犬模型中發(fā)現(xiàn),心房肌組織中的AngⅡ較對照組高3倍,提示AF存在心房局部腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活。Tsai等[12]已發(fā)現(xiàn)非家族性AF患者的AngⅡ基因多態(tài)性是對照者的2～3倍,證實(shí)RAAS基因多態(tài)性與家族AF有關(guān)。在人類基因組中的AT1R基因拷貝只有單一AT1R基因,位于3號染色體長臂21～25區(qū)[13],轉(zhuǎn)錄一段包含 5個(gè)外顯子、長 47kb的前mRNA,其中第五外顯子上具有AT1R的開放閱讀框架,人類AT1R基因cDNA序列全長 1563bp,編碼一段分子質(zhì)量為41060的359個(gè)氨基酸序列,即 AT1R[14]。法國學(xué)者 Bonnardeaux等[7]在1994年報(bào)道了AT1R基因多態(tài)性與高血壓病的相關(guān)性。檢測出人類AT 1R基因存在5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn):T573-C,A1062-G,A 1166-C,G 1517-T,A 1878-G,未發(fā)現(xiàn)致氨基酸序列變化的功能性突變點(diǎn),并且在病例對照研究中發(fā)現(xiàn)只有位于3'端非翻譯區(qū)的5'末端的A 1166-C多態(tài)性存在突變頻率差異。目前研究較多并顯示與臨床關(guān)系最密切的是A1166/C。Judith等[15]的研究提示攜帶AT1R基因1166位點(diǎn)C等位基因者,AT1R能對AngⅡ產(chǎn)生更強(qiáng)的血管收縮反應(yīng),并且對AT1R阻斷劑更為敏感。

本研究結(jié)果顯示,房顫組AC+CC基因型頻率、C等位基因頻率均較對照組增高,AC型+CC型發(fā)生AF的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于AA型。這可能與受體性能改變,心房局部RAAS活性增強(qiáng)有關(guān)。除基因型外,收縮壓對增加總體AF發(fā)生的概率亦有顯著性作用,可能是RAAS活性增強(qiáng)的全身作用,說明RAAS活性增強(qiáng)可以是AF、高血壓的共同病理生理基礎(chǔ)。盧全生等[16]對206例高血壓患者(陰虛陽亢證156例,痰濕壅盛證30例,陰陽兩虛證20例)AT1R基因多態(tài)性研究結(jié)果,AA基因型和AC加CC基因型在高血壓病3種不同證候中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;比較其等位基因A和C在辨證分型中的分布頻率,差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。本研究的觀察,高血壓并 AF患者實(shí)證組與虛證組基因型頻率及等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),提示高血壓并AF病程發(fā)展中的不同中醫(yī)證候與AT1R基因A1166C多態(tài)性無顯著性關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量有限的結(jié)果提示,攜帶A T1R基因1166位點(diǎn)C等位基因者有增加發(fā)生AF風(fēng)險(xiǎn)的傾向,可能與RAAS活性增強(qiáng)有關(guān)。此外,高血壓并AF病程發(fā)展中的不同中醫(yī)證候與AT1R基因A1166C多態(tài)性無顯著性關(guān)系。然而,AF發(fā)生發(fā)展的因素眾多而復(fù)雜,相信大樣本、多中心分子生物學(xué)調(diào)查,一定會(huì)揭示AF的遺傳因素,必將使AF的預(yù)防和治療發(fā)生根本性的改變。

[1]K rahn AD,M anfreda J,Tate RB,et al.The natural history of atrial fibrillation:Incidence,risk factors,and prog nosis in the manitoba follow up study[J].Am J Med,1995,98:476-484.

[2]Feinberg WM,Blackshear JL,Laupacis A,et al.Prevalence age distribution and gender of patients with atrial fibrilliation:Analysis and implications[J].Arch Intern Med,1995,155:469-473.

[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì).中國部分地區(qū)心房顫動(dòng)住院病例回顧性調(diào)查[J].中華心血管病雜志,2003,31(12):913-916.

[4]周自強(qiáng),胡大一,陳捷,等.中國心房顫動(dòng)現(xiàn)狀流行病學(xué)研究[J].中華內(nèi)科雜志,2004,43(7):491-494.

[5]中國高血壓防治指南修訂委員會(huì).中國高血壓防治指南(修訂版)[J].高血壓雜志,2005,13(Suppl):1-40.

[6]鄭筱萸.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2002:73-77.

[7]Bonnardeaux A,Davies E,Jeunemaitre X,et al.AngiotensinⅡtype 1 receptor gene polymorphisms in human essential hypertension[J].Hypertension,1994,24(1):63-69.

[8]金冬雁,黎孟楓,曹明,等.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第2版.北京:科學(xué)出版社,1992:448-449.

[9]Goette A,Staack T,Rocken C,et al.Increased expression of extracellular signal-regulated kinase and angiotensin-converting enzyme in human atria during atrial fibrillation[J].J Am Coll Cardiol,2000,35(6):1669-1677.

[10]Kumagai K,Nakashima H,Urata H,et al.Effects of angiotensinⅡtype 1 receptor antagonist on electrical and structural remodeling in atrial fibrillation[J].J Am Coll Cardiol,2003,18:2197-2204.

[11]Li D,Fareh S,Leung TK,et al.P romotion of atrial fibrillation by heart failure in dogs:A trial remodeling of a different sort[J].Circulation,1999,100(1):87-95.

[12]Tsai CT,Lai LP,Lin JL,et al.Renin-angiotensin system gene polymorphisms and atrial fibrillation[J].Circulation,2004,109(13):1640-1646.

[13]Katsuya T,Higaki J,Ogihara T.Gene loci and polymorphisms of angiotensinⅡreceptor[J].Nippon Rinsho,1999,57(5):1020-1027.

[14]Konishi H,Kuroda S,Inada Y,et al.Novel subtype of human angiotensinⅡtype 1 receptor:cDNA cloning and ex pression[J].Biochem Biophys Res Commun,1994,199(2):467-474.

[15]Judith A,Miller,Kerri Thai,et al.AngiotensinⅡtypeⅠreceptor gene polymo rphism predicts response to losartan and angiotensinⅡ[J].Kidney International,1999,56:2173-2180.

[16]盧全生,雷燕,陳可冀.AT1R基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓中醫(yī)證型及降壓中藥療效的關(guān)系[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,25(8):682-686.