丁亞芳,宮麗鴻,高 峰,劉 丹,高冬梅,杜玉杰

動(dòng)脈粥樣硬化(atheroscierosis,AS)是心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ),也是臨床心腦血管疾病發(fā)生和引起死亡的主要原因。AS是一種特殊的慢性炎癥過(guò)程,這種炎癥過(guò)程源于血漿脂蛋白、各種細(xì)胞組分與動(dòng)脈壁細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用[1,2]。近年來(lái)患病人群有逐步年輕化趨勢(shì)[3],嚴(yán)重危害人類身體健康。因此,研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞功能及代謝的變化對(duì)探討AS發(fā)病機(jī)制具有重要意義。血管緊張素Ⅱ(angiotensionⅡ,AngⅡ)可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷,誘發(fā)血管炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究搜風(fēng)祛痰法

對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κ B)mRNA及內(nèi)皮素-1(ET-1)mRNA表達(dá)的影響來(lái)預(yù)防AS的發(fā)生,并為治療AS提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物 活心湯組方:全蝎 15 g,蜈蚣2條,地龍20 g,陳皮15 g,半夏15 g,白術(shù)15 g,水蛭 15 g。由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局提供,加工制成含生藥2 g/mL中藥濃縮液4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動(dòng)物 健康新西蘭大耳白兔(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)清潔級(jí),雌雄不拘,體重2.0 kg～2.5 kg。

1.3 儀器 高速冷凍離心機(jī)(Sigma 3C15K美國(guó));超凈工作臺(tái)(蘇州凈化公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(THEROM HERAce11150);倒置顯微鏡(OLYMPUS IX71);PCR儀(Biometra UnioⅡ型,德國(guó));紫外分光光度計(jì)(UV-3000,英國(guó));凝膠自動(dòng)成像及分析系統(tǒng)(Chemi Imager 5500,美國(guó))。

1.4 試劑 AngⅡ(美國(guó)Sigma公司);胰蛋白酶(Gibco公司);DMEM(美國(guó)gibco公司);PCR引物(北京華大基因公司合成);胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)。

1.5 藥物血清制備 隨機(jī)將兔分為4組,空白對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組,每組5只。后3組分別灌胃活心湯,以人臨床用量×動(dòng)物等效計(jì)量比值×血清稀釋度為參考給藥量,空白對(duì)照組給等容積的蒸餾水。連續(xù)5 d,第5天灌胃后2 h頸動(dòng)脈放血,分離血清,56℃30 min滅活,低溫干燥,置-80℃保存?zhèn)溆?臨用時(shí)用DM EM培養(yǎng)液配成10 mg/mL的濃度,再用0.22 μ m 的微孔濾膜過(guò)濾除菌。

1.6 HUVEC培養(yǎng)及鑒定 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株原代(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)檢驗(yàn)科提供),用含20%胎牛血清的DMEN/F12培養(yǎng)基在37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合狀態(tài),再用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代。培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞形態(tài)符合內(nèi)皮細(xì)胞特征,抗人ⅤⅢ因子抗體染色陽(yáng)性。將培養(yǎng)的第2-3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.7 實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)分5組:正常對(duì)照組(空白血清);AngⅡ組(0.5μ mol/L)組;低濃度中藥血清+AngⅡ組:0.5 μ mol/L AngⅡ+2.5%中藥血清;中濃度中藥血清+AngⅡ組:0.5 μ mol/LAngⅡ+5%中藥血清;高濃度中藥血清+AngⅡ組:0.5 μ mol/L AngⅡ+10%中藥血清。用中藥血清事先孵育2 h后再加入 AngⅡ0.5 μ mol/L刺激2 h,收集細(xì)胞。

1.8 RT-PCR法測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞NF-κ B、ET-1 mRNA 采用Trizol試劑一步法提取組織總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定純度并定量。根據(jù)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)提供的NF-κ B及 ET-1和內(nèi)參照β-actin的mRNA序列,應(yīng)用軟件Primer Premier 5.0自行設(shè)計(jì)引物。詳見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

反應(yīng)條件:94℃5 min,1個(gè)循環(huán);94℃30 s,59℃30 s,72℃1 min,35個(gè)循環(huán);72℃5 min后結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng)。取5 μ L PCR產(chǎn)物與2 μ L Lodding Buffer混合,進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,100 V 1.5 h,電泳結(jié)束后,凝膠成像儀成像分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS12.0軟件,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s),兩組間比較用t檢驗(yàn),多組間比較用方差分析,相關(guān)分析采用直線相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1 活心湯對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞 NF-κ B mRNA表達(dá)的影響 正常對(duì)照組 NF-κ B mRNA表達(dá)最低,AngⅡ組表達(dá)明顯高于其他4組(P＜0.05)。3個(gè)中藥血清組 NF-κ B mRNA表達(dá)比AngⅡ組顯著降低(P＜0.05),與低濃度組中藥血清相比,中高濃度中藥血清組抑制NF-κ BmRNA表達(dá)更加明顯(P＜0.05)。詳見(jiàn)表1。

圖1 血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κ B mRNA表達(dá)

2.2 活心湯對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1 mRNA表達(dá)的影響 正常對(duì)照組 ET-1 mRNA表達(dá)最低,AngⅡ組的 ET-1 mRNA表達(dá)明顯高于其他4組(P＜0.05)。3個(gè)中藥血清組ET-1 mRNA表達(dá)比AngⅡ組顯著降低(P＜0.05),與低濃度組中藥血清相比,中高濃度中藥血清組抑制ET-1 mRNA表達(dá)更加明顯(P＜0.05)。詳見(jiàn)圖 2。

圖2 血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1 mRNA表達(dá)

3 討 論

血管內(nèi)皮是位于血管腔內(nèi)面的單層細(xì)胞上皮,介于血液和平滑肌之間,不僅起一種機(jī)械的屏障作用,還參與多種調(diào)節(jié)機(jī)制,因而成為血管疾病的一個(gè)基本靶點(diǎn)和調(diào)節(jié)點(diǎn)?，F(xiàn)已證實(shí),內(nèi)皮功能紊亂貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的各個(gè)階段[4]。

NF-κ B是Sen和Baltimore首先報(bào)道,是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強(qiáng)子κ B序列特異結(jié)合的蛋白因子,具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用,尤其在細(xì)胞因子誘導(dǎo)的基因表達(dá)中起關(guān)鍵性調(diào)控作用。細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí),NF-κ B以無(wú)活性的三聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,受到多種細(xì)胞因子激活,啟動(dòng)和調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[5]。這些因子在機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用[6,7]。新近研究發(fā)現(xiàn),NF-κ B亦存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell,SMC)及心肌細(xì)胞中,參與多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程[8-10]。NF-κ B依賴性基因協(xié)同誘導(dǎo)表達(dá),促使血管壁產(chǎn)生動(dòng)脈硬化效應(yīng),這種效應(yīng)持續(xù)存在,刺激SMCs遷移、增殖,使循環(huán)血單核細(xì)胞不斷聚集,進(jìn)一步產(chǎn)生細(xì)胞因子、化學(xué)因子、生長(zhǎng)因子,因此 NF-κ B在致AS信號(hào)初始反應(yīng)、進(jìn)展中均扮演重要角色[11]。

ET是1988年日本學(xué)者Yanagisawa等從豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中分離純化的一種多肽物質(zhì),是內(nèi)皮細(xì)胞依賴性收縮因子的主要成分,是迄今最強(qiáng)的血管收縮因子[12]。ET有3種同分異構(gòu)體:ET-1、ET-2和ET-3。其中 ET-1的心血管效應(yīng)最強(qiáng)。動(dòng)脈粥樣硬化早期的一項(xiàng)病理生理變化是單核細(xì)胞向血管內(nèi)膜層移行、活化并刺激多種因子釋放。已在體外證實(shí),內(nèi)皮素能夠作為單核細(xì)胞趨化劑使用,因此內(nèi)皮素可能是動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)始動(dòng)因子,也能夠刺激血管平滑肌細(xì)胞的移行和增生,從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程[13]。

AS可涉及祖國(guó)醫(yī)學(xué)癡呆、中風(fēng)、胸痹、真心痛、厥心痛、痰飲等病癥。本病的病理變化為本虛標(biāo)實(shí),虛實(shí)夾雜。本虛可累及心、肝、脾、腎四臟,為病之本,以痰瘀毒互阻為病之標(biāo),正虛邪實(shí)相互影響,致使病變不斷發(fā)展。正如《血證論》瘀血既久亦可化痰水。隨著生活水平的提高和生活方式的改變,過(guò)食肥甘厚味、嗜好煙酒,釀生痰濁瘀血的胸痹患者日益增多。痰濁能使LDL升高,LDL可使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ET-1,從而增加內(nèi)皮素的形成和釋放[14],AngⅡ可以使血管收縮引起血瘀,而中醫(yī)有津血同源理論,且津停為痰,又認(rèn)為久病入絡(luò),宜搜風(fēng)通絡(luò)祛痰,治血與治風(fēng)相通,從痰從風(fēng)論治?；钚臏街腥?、蜈蚣具有熄風(fēng)止痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛之效。地龍具有清熱熄風(fēng),通絡(luò)利尿之效。陳皮半夏白術(shù)三者既能燥濕化痰,又能理氣健脾消痞散結(jié)。水蛭為蟲(chóng)類活血化瘀藥,破血逐瘀而不傷新血。諸藥合用共奏搜風(fēng)祛痰,祛瘀通絡(luò)之功效?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí),全蝎中含卵磷脂是膽堿的供體,可減少和清除血管壁上膽固醇的沉積,降低血液黏稠度,改善血氧供應(yīng)。蜈蚣有抗心肌缺血、抗炎、鎮(zhèn)痛、改善機(jī)體免疫功能、抗衰老等作用[15-16],地龍具有解熱鎮(zhèn)靜、抗驚厥、平喘、抗血栓、降壓等作用[17];陳皮提取物有明顯的清除自由基、羥自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用,對(duì)自由基引起的細(xì)胞膜氧化損傷有保護(hù)作用[18],并能抗衰老、增強(qiáng)生命活力。水蛭能增加腦血流量,改善腦缺氧狀況,降低血流黏稠度及降血脂,抑制體內(nèi)外血栓形成[19]。上藥合用,能夠更好地起到防止動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示,血管緊張素Ⅱ可引起細(xì)胞內(nèi)皮損傷,導(dǎo)致VEC功能紊亂,加劇炎癥反應(yīng),致使 NF-κ B mRNA及 ET-1 mRNA表達(dá)升高,搜風(fēng)祛痰法能有效地抑制細(xì)胞損傷后NF-κ B mRNA及 ET-1 mRNA表達(dá),改善血管內(nèi)皮功能,減輕內(nèi)皮損傷,從而有效地防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展,為治療 AS提供理論基礎(chǔ),但其全面深入的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究探討。

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