馬國(guó)英,楊小榮,趙 欣,趙晉楓,秦華平,史瑞紅,張 策

鏈脲佐菌素(STZ)是一種烷基化物,腦室注射STZ可以導(dǎo)致正常大鼠出現(xiàn)阿爾茨海默病(AD)樣的病理退行性變化,如線粒體功能異常、神經(jīng)元死亡、學(xué)習(xí)記憶與認(rèn)知的障礙等[1]。在離體神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)中可以引起細(xì)胞活力的下降,活細(xì)胞數(shù)目的減少,乳酸脫氫酶(LDH)的釋放增加。其機(jī)制可能是削弱或破壞胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),破壞胰島素受體的自身磷酸化和內(nèi)在酪氨酸激酶活性,增加磷酸化酪氨酸磷酸酶的活性[1]。導(dǎo)致胰島素信號(hào)傳導(dǎo)障礙,引起葡萄糖代謝紊亂和能量生成受阻。

Humanin(HN)是在AD病人大腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)的由24個(gè)氨基酸組成的線性多肽[2],能夠有效抑制多種 FAD(Family Alzheimer’s disease)基因突變和 Aβ衍生物誘發(fā)的神經(jīng)毒作用,初始被認(rèn)為是 AD特異性或AD相關(guān)毒性的神經(jīng)保護(hù)肽。抑制APP、PS1、PS2突變誘發(fā)的神經(jīng)元死亡,拮抗Aβ完整肽鏈以及Aβ片斷誘導(dǎo)的神經(jīng)毒作用[3]。HN的作用機(jī)制還不清楚,但隨著科學(xué)研究的逐步深入研究發(fā)現(xiàn),HN可以拮抗NMDA所致的興奮毒[4],拮抗缺氧所致的皮層神經(jīng)元損傷[5],拮抗OA通過(guò)誘導(dǎo)tau蛋白過(guò)度磷酸化所致的神經(jīng)毒[6]。提示HN具有廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用,我們前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)STZ對(duì)離體培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞有損傷作用,本實(shí)驗(yàn)旨在探討HN是否對(duì)STZ的神經(jīng)損傷有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用新生1 d～3 d的Wistar大鼠,雌雄不限。STZ、Calcein-AM 購(gòu)于Sigma公司,HN由上海生工合成胎牛血清(FBS)購(gòu)于杭州四季青公司,將STZ溶于D-Hanks溶液中,配成 10 mmol/L的母液,由于STZ溶液的半衰期在生理pH值條件下為19 min[7],需要溶解后立即使用。HN溶于三蒸水,配成 1 mmol/L的溶液,0.2 μ mol/L濾器過(guò)濾除菌,分裝,-20℃保存待用。

1.2 原代皮層神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng) 用新生1 d～3 d的Wistar大鼠,將大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞分離成單細(xì)胞懸液,經(jīng)1 000 r/min離心5 min,按細(xì)胞的濃度為1×106/L接種于96孔板或培養(yǎng)皿中,放在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)到第7天時(shí),將培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞隨機(jī)分組:由于中樞的胰島素主要來(lái)自?xún)煞矫?由胰島產(chǎn)生即外周血漿中的胰島素透過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞和神經(jīng)組織自身合成的胰島素[5],為了更好的模擬在體的情況,所以在實(shí)驗(yàn)中都加入胰島素15 μ U/mL。對(duì)照組、STZ組以全培液培養(yǎng);HN組加入終濃度分 別為 0.1 μ mol/L、1 μ mol/L、10 μ mol/L、100 μ mol/L 的HN,16h后除了對(duì)照組以外,其他組都加入STZ(100μ mol/L)。在他們共同作用 36 h后觀察細(xì)胞的活力以及活細(xì)胞數(shù)目(LDH,CCK-8和Calcein-AM染色)。

1.4 細(xì)胞活力分析 在96孔板中培養(yǎng)的皮層神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)提前16 h加入 HN,再經(jīng)STZ誘導(dǎo)36 h后,換新的全配液,每空加入10μ L的CCK-8,37℃避光培養(yǎng)2 h,到酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm吸光度值。

1.5 LDH釋放的檢測(cè) 將皮層神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中,經(jīng)提前16 h加入HN,再加入STZ誘導(dǎo)36 h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行LDH活性的檢測(cè)。

1.6 Calcein-AM染色 將神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)在有玻片的培養(yǎng)皿中,經(jīng)提前16 h加入 HN,再加入STZ誘導(dǎo) 36 h后,用 PBS液沖洗3次,加入終濃度為10 μ mol/L的 Calcein-AM,37℃避光培養(yǎng)20 min,再經(jīng)PBS避光洗滌3次后,在激光共聚焦顯微鏡(Olympus,FV-1000)下觀察細(xì)胞,激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為515 nm拍片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 由SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,進(jìn)行單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8的測(cè)定 STZ組與對(duì)照組比較,細(xì)胞活力明顯下降,STZ組由對(duì)照組的 100%降至45.56%(P＜0.01);提前16 h加入HN(0.1μ mol/L)不能抑制STZ引起的細(xì)胞活力下降(P＞0.05),1 μ mol/L HN可以拮抗由STZ引起的細(xì)胞損傷,細(xì)胞活力升高了 28.47%(P ＜0.05),10 μ mol/L 、100 μ mol/L HN細(xì)胞活力升高了48.47%、53.04%(P＜0.01)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 HN保護(hù)STZ誘導(dǎo)皮層神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用(CCK-8檢測(cè))

2.2 Calcein-AM染色 STZ處理后,活細(xì)胞的數(shù)量明顯減少,伴有突起的數(shù)目明顯減少;提前加入 HN(0.1 μ mol/L)不能抑制STZ引起的活細(xì)胞數(shù)目減少;提前加入 HN(1 μ mol/L)可以減少STZ引起的活細(xì)胞數(shù)目減少,和突起數(shù)目有所增加,HN(10 μ mol/L、100 μ mol/L)明顯的抑制STZ引起的活細(xì)胞數(shù)目減少,而且突起數(shù)目更加明顯。

2.3 LDH釋放的檢測(cè) STZ組與對(duì)照組比較,LDH的含量明顯增加,釋放量增加52.75%(P＜0.01),0.1 μ mol/L HN不能抑制STZ引起的細(xì)胞損傷,使LDH的釋放減少9.36%(P＞0.05);1 μ mol/L HN可以降低有 STZ引起的細(xì)胞損傷,使LDH的 釋放減少18.76%(P＜0.05);10μ mol/L、100μ mol/LHN可以明顯降低由STZ引起的細(xì)胞損傷,使LDH的釋放減少21.05%和23.65%(P＜0.01)。詳見(jiàn)圖2。

圖2 HN保護(hù)STZ誘導(dǎo)皮層神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用(LDH釋放水平檢測(cè))

3 討 論

中樞胰島素主要由胰島產(chǎn)生即外周血漿中的胰島素透過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞,然而研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)組織自身也可以合成胰島素并參與代謝調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用[8]。此外研究顯示胰島素受體在腦內(nèi)皮層、海馬等與認(rèn)知功能密切相關(guān)的區(qū)域分布較密集。胰島素通過(guò)它與細(xì)胞膜上的胰島素受體(IR)相結(jié)合,通過(guò)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程激發(fā)細(xì)胞內(nèi)特定的生理生化反應(yīng)。

研究證實(shí),糖代謝紊亂和AD發(fā)病機(jī)制有密切的聯(lián)系,尤其在晚發(fā)性AD中,糖代謝紊亂可能是重要的始動(dòng)因子。多種證據(jù)顯示腦內(nèi)糖代謝障礙可以引起認(rèn)知功能受損,而認(rèn)知功能障礙為主的AD常伴有腦內(nèi)糖代謝障礙。由于糖代謝紊亂(糖尿病)與AD間有著非常密切的聯(lián)系,有可能存在同樣的發(fā)病因素和病理過(guò)程,因而有專(zhuān)家提出AD可能是一種大腦特異的神經(jīng)內(nèi)分泌疾病或者稱(chēng)“3型糖尿病”[9]。

HN是一個(gè)由24個(gè)氨基酸組成的線性多肽,在AD病人未受損的腦區(qū)發(fā)現(xiàn),具有很強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用。初始認(rèn)為HN是AD特異性的神經(jīng)保護(hù)因子,因?yàn)檠芯堪l(fā)現(xiàn)HN主要抑制與AD發(fā)病和病理變化密切相關(guān)的一些毒性因素,如HN可以抑制APP、PS1、PS2突變誘發(fā)的神經(jīng)元死亡,拮抗Aβ完整肽鏈及Aβ片斷誘導(dǎo)的神經(jīng)毒作用。但隨著研究的深入發(fā)現(xiàn),HN可能具有較廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用。我們前期的實(shí)驗(yàn)觀察也證實(shí)HN可以拮抗缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)損傷,拮抗NMDA引起的神經(jīng)損傷。因此HN可能不像研究者提出的那樣,只是一種特異的針對(duì)AD損傷的神經(jīng)保護(hù)因子,而有可能是一個(gè)廣譜的神經(jīng)保護(hù)因子。本實(shí)驗(yàn)以離體神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的方法證實(shí)HN可拮抗STZ對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用,包括細(xì)胞活力的逐漸增加,LDH的釋放逐漸增少,以及活細(xì)胞數(shù)目的逐漸增加,并有劑量依賴(lài)性的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為HN作為廣譜神經(jīng)保護(hù)因子提供了新的證據(jù)。由于HN具有的強(qiáng)大的和較為廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用,因而可能在神經(jīng)退行性疾病包括AD的防治都具有重要意義。HN可拮抗STZ誘導(dǎo)的培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

[1] Steen E,T erry BM,Rivera EJ,et al.Impaired insulin and insulinlike growth factor expression and signaling mechanisms in Alzheimer’s disease is this type 3 diabetes[J].J Alzheimers Dis,2005,7:63.

[2] Hashimoto Y,Niikura T,Tajima H,et al.A rescue factor abolishing neuronal cell death by a wide spectrum of familial Alzheimer’s disease genes and Aβ[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:6336-6341.

[3] Hashimoto Y,Ito Y,Niikura T,et al.M echanism of neuropretection by a novel rescue factor humanin from Swedish mutant amyloid precursor protein[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,283:460-468.

[4] 崔愛(ài)玲.Humanin拮抗NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒的作用觀察[D].山西醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文,2007.

[5] 趙珅婷.Humanin保護(hù)培養(yǎng)皮層神經(jīng)元缺氧性作用損傷作用的觀察[D].山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文,2006.

[6] 趙晉楓.Humanin拮抗岡田酸通過(guò)誘導(dǎo)T au蛋白過(guò)度磷酸化所致神經(jīng)毒的作用研究[D].山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文,2007.

[7] Muller D,Nitsch RM,Wurtman RJ,et al.Streptozotocin increases free fatty acids and decreases phospholipids in rat brain[J].J Neural Transm,1998,105:1271-1281.

[8] 盛樹(shù)力.老年性癡呆及相關(guān)疾病[M].北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社,2006:226-266.

[9] Sun M K,Alkon DL.Links between Alzheimer’s disease and diabetes[J].Drugs Today(Barc),2006,42:481.