劉翔，劉布鳴，何開(kāi)家，陳明生，林 霄

（1.廣西中醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530001； 2.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022）

闊葉十大功勞 Mahonia bealei(Fort.)Carr.為小檗科十大功勞屬植物，其干燥葉為藥材十大功勞葉，含有小檗堿、藥根堿、尖刺堿、巴馬汀、小檗胺、木蘭堿等成分[1]，功能清虛熱、燥濕、解毒，臨床用于治療肺癆咳血、骨蒸潮熱、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、濕熱黃疸、帶下、痢疾、風(fēng)熱感冒、目赤腫痛、癰腫瘡瘍等癥[2]。藥材市場(chǎng)上經(jīng)常以同屬植物長(zhǎng)柱十大功勞作為闊葉十大功勞使用。有人從長(zhǎng)柱十大功勞中分離提取到小檗堿、藥根堿、巴馬汀、異粉防己堿和"－谷甾醇[3]。但兩種十大功勞葉的含量測(cè)定方法均未見(jiàn)報(bào)道，為了更有效地控制十大功勞葉藥材的質(zhì)量，比較兩者的成分差異，筆者以反相高效液相色譜（RP－HPLC）法測(cè)定兩者中藥根堿、巴馬汀和小檗堿的含量，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

KQ5200B 型超聲波儀（江蘇昆山，160 W，40 kHz）；TG328A 型分析天平（上海）；LC9000型高效液相色譜儀，WM2010型通用多媒體色譜工作站（南寧威瑪龍公司）。闊葉十大功勞 Mahonia bealei(Fort.)Carr.干燥葉，長(zhǎng)柱十大功勞 Mahonia duclouxiana Gagnep.干燥葉，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院何開(kāi)家副教授鑒定。鹽酸藥根堿對(duì)照品（批號(hào)為0733－200005，供鑒別用），鹽酸巴馬汀對(duì)照品（批號(hào)為110732－200506，供含量測(cè)定用），鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)為1101713－200208，供含量測(cè)定用），均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：大連依利特Sino Chrom ODS－BP柱（250 mm×4.6 mm，5!m）；流動(dòng)相：乙腈 －0.2% 磷酸（23 ∶77）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10!L。在此條件下，柱效按鹽酸小檗堿峰計(jì)算，理論塔板數(shù)為14 501。鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的分離度分別為12.89，12.34，3.66，均可完全分離（見(jiàn)圖1）。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱取鹽酸藥根堿對(duì)照品 9.5 mg、鹽酸巴馬汀對(duì)照品9.2 mg、鹽 酸 小 檗 堿 對(duì) 照 品10.5 mg，分別置 10 mL 量瓶，以流動(dòng)相稀釋至刻度，作為對(duì)照品貯備液（含鹽酸藥根堿0.95g/L，鹽酸巴馬汀 0.92 g/L，鹽酸小檗堿 1.05 g/L）。分別精密吸取上述貯備液 1.18，0.23，0.22mL，混合于25 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液（鹽酸藥根堿44.84!g/mL，鹽酸巴馬汀8.46!g/mL，鹽酸小檗堿9.24!g/mL）。精密量取高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液0.8 mL用流動(dòng)相定容至10 mL容量瓶，搖勻，作為低質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液（鹽酸藥根堿3.59!g/mL、鹽酸巴馬汀0.68!g/mL、鹽酸小檗堿0.74!g/mL）。取干燥葉粉碎，過(guò) 20 目篩，取 0.25 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入鹽酸 －甲醇（1∶100）溶液約20 mL，超聲處理60 min，放冷至室溫，用鹽酸－甲醇（1∶100）溶液定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液10 mL至蒸發(fā)皿中，水浴60℃以下蒸干，放冷，殘?jiān)尤肓鲃?dòng)相使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶，稀釋至刻度，搖勻，0.45!m微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品貯備液各0.38,0.14,0.22 mL，混合于 10 mL量瓶中，用流動(dòng)相定容，制得混合對(duì)照品溶液（鹽酸藥根堿 36.1!g/mL，鹽酸巴馬汀 12.88!g/mL，鹽酸小檗堿 23.1!g/mL）。再分別取上述混合對(duì)照品溶液 0.04,0.52,1.00,1.48,1.96 mL，置 10 mL 量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，制得5個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣10!L，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（!g）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得鹽酸藥根堿回歸方程 Y=2 ×10－7X －0.001 1，r=0.999 9，進(jìn)樣量線性范圍是0.001 444～0.070 76!g；鹽酸巴馬汀回歸方程 Y=2×10－7X －3×10－4，r=0.999 6，進(jìn)樣量線性范圍是 0.000 515 2～0.025 24!g；鹽酸小檗堿回歸方程 Y=2×10－7X+2×10－5，r=0.999 8，進(jìn)樣量線性范圍是 0.000 924 0 ～0.045 28!g。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下低質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液10!L，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的 RSD分別為1.46%,1.32%,1.88%。精密吸取2.2項(xiàng)下同一供試品溶液10!L，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的 RSD分別為1.40%,1.60%,1.90%。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于 0，12，24，48，72 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為1.53%,1.41%,1.26%，表明供試品溶液在3 d內(nèi)穩(wěn)定。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：依法制備6份供試品溶液并進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿平均含量分別為0.4129，0.08905，0.108 5 mg/g，RSD 分別為 1.47%，1.94%，2.20%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品細(xì)粉9份，約0.125 g，精密稱定，分別精密加入 2.2 項(xiàng)下高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液 0.8,1.0,1.2 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液并依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

分別取不同產(chǎn)地的樣品細(xì)粉，按2.2項(xiàng)下方法平行制備2份供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)柱十大功勞葉與闊葉十大功勞葉含有相同的化學(xué)成分，但含量差異很大，即使為同種植物，不同產(chǎn)地的含量差異也很大。

邢俊波等[4]曾發(fā)現(xiàn)鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液在265 nm波長(zhǎng)處吸收值最大、靈敏度最高，故以此為測(cè)定波長(zhǎng)。試驗(yàn)中曾考察了超聲提取、回流提取、索氏提取器提取3種方法，發(fā)現(xiàn)前兩者巴馬汀的含量差不多，但超聲提取藥根堿和小檗堿的含量遠(yuǎn)高于其他兩種方法，考慮到小檗堿對(duì)熱不穩(wěn)定性[5]及操作簡(jiǎn)便性，故采用超聲提取。高溫條件下鹽酸小檗堿易氧化變質(zhì)[5－6]，在蒸干甲醇時(shí)應(yīng)注意水浴溫度，經(jīng)試驗(yàn)摸索，水浴溫度60℃蒸干與室溫下自然揮干所測(cè)得含量無(wú)差異，而當(dāng)水浴溫度為75℃時(shí)鹽酸小檗堿含量減半，當(dāng)以水蒸氣蒸干時(shí)鹽酸小檗堿含量?jī)H為60℃水浴蒸干的1/4。

筆者建立的RP－HPLC法可同時(shí)分離并測(cè)定闊葉十大功勞葉與長(zhǎng)柱十大功勞葉中的3種小檗堿型生物堿，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，既可用于十大功勞屬植物中小檗堿型生物堿的考察，也可為含藥根堿、巴馬汀、小檗堿藥材和中藥制劑的常規(guī)檢驗(yàn)提供參考。

[1]宋德勛.兩種功勞葉藥材鑒別[J].時(shí)珍國(guó)藥研究,1997,8(4):343－344.

[2]國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:320－321.

[3]何開(kāi)家,劉布鳴,盧文杰.長(zhǎng)柱十大功勞的化學(xué)成分研究(")[J].華西藥學(xué)雜志,2008,23（2）:172 － 173.

[4]邢俊波,徐今寧,吳 禾,等.HPLC法測(cè)定婦泰軟膠囊中生物堿的含量[J].中國(guó)新藥雜志,2005,14(12):1 148－1 150.

[5]彭宗玢,朱天明.溫度對(duì)鹽酸小檗堿質(zhì)量的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2002,13(10):45.

[6]朱天明,馬偉東.鹽酸小檗堿及其片劑中有關(guān)物質(zhì)檢查方法的探討[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn),2006,7(4):60－61.