王維亭，于 冰，趙專友，湯立達(dá)

（天津藥物研究院藥效動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

腦卒中發(fā)病率高、后果嚴(yán)重，是死亡與致殘的最主要疾病之一。隨著對(duì)腦梗死治療的研究進(jìn)展，逐漸認(rèn)識(shí)到了多功能、多作用靶點(diǎn)治療藥物對(duì)于臨床預(yù)后的優(yōu)越性，尤其是兼具溶栓、降纖、血小板聚集抑制等多功能的藥物，但目前對(duì)該類藥物的研發(fā)尚缺乏合理的、有針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本試?yàn)建立了一種可用于多功能藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)的新的微血栓栓塞中風(fēng)模型，該模型適用于亞急性或慢性試驗(yàn)，并通過(guò)巴曲酶驗(yàn)證了其應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器、動(dòng)物與試藥

XHF－1型高速分散器（上海金達(dá)生化儀器廠）；HS3120型超聲振蕩器（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；PK121R型低溫冷凍離心機(jī)（意大利ALC公司）；Model550型光吸收酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio－RAD公司）；Parber凝血因子分析儀(北京世帝公司)。雄性新西蘭大白兔，體重(2.0 ～2.7)kg，平均（2.4 ±0.2)kg，由天津藥物研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為津?qū)崉?dòng)質(zhì)字第001號(hào)。巴曲酶[Batroxobin，5個(gè)巴曲酶單位（BU）/0.5 mL，北京托比西藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20041127]。組織型纖溶酶原激活劑（t－PA）含量測(cè)定試劑盒（上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司，批號(hào)為41110）。

1.2 模型制備

微栓子制備：自供體家兔頸動(dòng)脈取全血5 mL，凝固后置37℃水浴中老化3 h,取出血凝塊,剪碎，懸浮于含0.1%小牛血清白蛋白（BSA）的磷酸鹽生理鹽水緩沖液（PBS）中,經(jīng)高速分散器在5 000 r/min及10 s的條件下粉碎，收集通過(guò)230!m×230!m的尼龍篩網(wǎng)的微栓子,再經(jīng)130!m×130!m的尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾，將留于網(wǎng)上的血栓懸浮于PBS中備用。微栓子大小在130～230!m之間。

栓塞過(guò)程：取雄性家兔，體重（2.4±0.2)kg,乙醚麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部去毛，分別以碘酒、酒精消毒手術(shù)野，頸正中線切開(kāi),分離皮下組織及筋膜；游離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)和頸外動(dòng)脈(ECA)。頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，近段切口，插入充滿生理鹽水（NS）的PE50管并逆向行進(jìn)至頸內(nèi)動(dòng)脈。取上述制備的不同量的微栓子，吸干稱重后，懸浮于2 mL PBS中，快速推入腦內(nèi)，再用5 mL NS緩慢沖洗。沖洗完畢后抽出插管并結(jié)扎頸外動(dòng)脈切口，縫合手術(shù)傷口，肌肉注射青霉素(10萬(wàn)U)后，回籠飼養(yǎng)。

1.3 分組及給藥

將動(dòng)物分為3組，即模型組（A組）、巴曲酶低劑量組（B1組）、巴曲酶高劑量組（B2組），每組20只。栓塞造模后5 min，經(jīng)耳緣靜脈給藥，給藥體積5 mL,給藥時(shí)間5 min。A組給予NS，B1組及B2組給予巴曲酶，劑量分別為0.5 BU/kg和1.0 BU/kg。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

致半數(shù)卒中微栓子量(ES50,effective stroke dose)：注射微栓子后出現(xiàn)神經(jīng)癥狀者為異常動(dòng)物（以1表示），無(wú)癥狀者為正常動(dòng)物（以0表示）。藥物治療后6 h及24 h時(shí)，觀察注射不同量微栓子后出現(xiàn)的異常卒中動(dòng)物數(shù)，求出不同時(shí)間的 ES50，以此考察藥物對(duì)腦卒中的治療作用。

t－PA含量測(cè)定：造模前及給藥后1 h，經(jīng)心臟取血2 mL，以1/10體積的0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝，3 000 r/min轉(zhuǎn)速低溫(4℃)離心10 min，－20℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收度，計(jì)算t－PA含量。

纖維蛋白原（Fbg）含量測(cè)定：造模前及給藥后1,2,4,6,24 h時(shí)，經(jīng)心臟取血2 mL，以1/10體積的0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝，3 000 r/min轉(zhuǎn)速低溫(4℃)離心10 min，－20℃保存。采用凝固法測(cè)定Fbg含量。

腦出血觀察：給藥后24 h，耳緣靜脈注射20%烏拉坦1 g/kg麻醉，開(kāi)胸，分別用NS和4%多聚甲醛PBS依次經(jīng)心臟灌注固定大腦，開(kāi)顱取腦，置4%多聚甲醛PBS繼續(xù)固定。1周后，將大腦沿冠狀面切成5 mm厚的切片，依據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)盲法觀察腦出血情況。出血類型分為4類，即蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH，在大腦表面的軟腦膜下有肉眼可見(jiàn)的血液）、出血性梗死(HI，在松軟的梗死組織中出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)）、點(diǎn)狀出血(PT，在腦組織內(nèi)出現(xiàn)散在的小紅斑）、實(shí)質(zhì)性腦內(nèi)出血(ICH，腦組織內(nèi)有大片的血液）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì) ES50及t－PA含量、Fbg含量的影響

結(jié)果見(jiàn)表1。可見(jiàn)，隨著顱內(nèi)注入微栓子量的增加，動(dòng)物出現(xiàn)中風(fēng)的幾率明顯增加，ES50值提示注入0.63 mg栓子6 h時(shí)即可使半數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)中風(fēng)癥狀；予巴曲酶0.5 BU/kg治療6 h及24 h后ES50,分別提高了2.2倍和1.8倍。A組t－PA含量在給藥前及給藥后基本保持穩(wěn)定，有降低趨勢(shì)；巴曲酶0.5 BU/kg及1.0 BU/kg給藥后1 h可使t－PA含量明顯增加，較A組分別增加14.04%和23.25%。A組Fbg含量在給藥前及給藥后基本保持穩(wěn)定；巴曲酶0.5 BU/kg及1.0 BU/kg給藥后可使Fbg含量明顯降低，與給藥前比較有顯著性差異，以給藥后6 h最為明顯。

表1 各組 ES50及 t－PA含量、Fbg含量測(cè)定結(jié)果（n=20，±s）

表1 各組 ES50及 t－PA含量、Fbg含量測(cè)定結(jié)果（n=20，±s）

注：與 A 組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01；與給藥前比較，□P ＜0.05，■P ＜0.01。

組別 劑量（BU/kg） ES50 t－PA(ng/mL)Fbg(g/L)A照 －B1組B2組0.5 1.0 6 h 0.63±0.57 1.41±0.51△2.00±0.59△24 h 0.52±0.54 0.93±0.65 1.44±0.47△基線2.42±1.04 2.39±1.00 2.38±0.69 1 h 2.28±0.85 2.60±0.96 2.81±1.08▲給藥前3.47±1.06 3.53±0.70 3.51±1.31 1 h 3.53±1.17 3.13±0.93□2.88 ±0.72△□2 h 3.52±0.77 2.98±1.04□2.87 ±1.11△■4 h 3.53±0.70 2.87±1.26□2.84±1.15△□6 h 3.47±0.90 2.82 ±0.81△□2.63 ±1.27△■24 h 4.57±1.59 4.14±1.56 4.13±1.34

2.2 對(duì)腦出血的影響

結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)，巴曲酶0.5 BU/kg及1.0 BU/kg給藥后對(duì)腦出血類型及出血率無(wú)明顯影響。

表2 兔大腦中動(dòng)脈微血栓栓塞后出血類型及巴曲酶的作用（n=20）

3 討論

大多數(shù)缺血性腦卒中是由血栓堵塞腦動(dòng)脈所致，其中大腦中動(dòng)脈是常見(jiàn)的栓塞血管。近年來(lái)，腦梗死溶栓治療的臨床應(yīng)用及其病理生理機(jī)制探索有了較大進(jìn)展，同時(shí)溶栓藥物的研究及用于評(píng)價(jià)溶栓藥物藥效學(xué)的模型受到了極大關(guān)注，因此，建立穩(wěn)定、客觀、科學(xué)的動(dòng)物模型對(duì)于溶栓藥物研究具有重要意義。

目前，用于腦梗死溶栓藥物評(píng)價(jià)的方法主要包括血管內(nèi)注入復(fù)合血栓誘導(dǎo)劑[1]、光化學(xué)法[2－3]及注入血栓栓子法。血管內(nèi)注入復(fù)合血栓誘導(dǎo)劑一般適用于小動(dòng)物，觀察指標(biāo)較單一；光化學(xué)法需向動(dòng)物體內(nèi)注入光化學(xué)誘導(dǎo)劑，栓塞部位在皮層、呈彌漫性，且誘導(dǎo)劑對(duì)生化指標(biāo)的檢測(cè)有一定干擾；栓子注入法最常用，國(guó)內(nèi)多采用大栓子栓塞法評(píng)價(jià)溶栓藥溶栓的效果，一般為急性試驗(yàn)研究。注入血栓栓子栓塞大腦中動(dòng)脈的方法，不需開(kāi)顱，且較符合臨床大血管栓塞特征。家兔是制作該模型的最常用動(dòng)物，其顱內(nèi)外血管之間無(wú)網(wǎng)狀吻合，與狗或貓相比更接近于人類[4]，且動(dòng)物溫馴、血容量大，便于多指標(biāo)研究。目前國(guó)內(nèi)以家兔制作大腦中動(dòng)脈血栓栓塞的方法一般采用大栓子，栓子規(guī)格為直徑 0.5～1.0 mm、長(zhǎng) 0.5～1.0 mm，栓子質(zhì)量為 2.5 ～ 3.5 mg[5－6]。該模型一般用于急性腦梗死研究（＜24 h）,但不便于對(duì)腦梗死進(jìn)行長(zhǎng)期、動(dòng)態(tài)的觀察。筆者參考國(guó)外方法建立了一種新的模型，即微血栓栓塞模型[7－9]。該模型利用神經(jīng)癥狀反應(yīng)的量子關(guān)系（有或無(wú)）及幾率，采用非線性擬合方法來(lái)評(píng)價(jià)藥物的作用，避免了神經(jīng)反應(yīng)輕重程度判斷的主觀性，以及梗死程度與反應(yīng)程度可能非正性相關(guān)的缺陷，同時(shí)可長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)觀察。國(guó)外研究者有觀察至21 d的報(bào)道[10]。該模型上，少量微栓子栓塞大腦中動(dòng)脈的范圍較小，不引起家兔神經(jīng)學(xué)行為異常；當(dāng)栓子量加大時(shí)，栓塞范圍也增加，動(dòng)物出現(xiàn)行為異常的幾率也增加，行為異?？杀憩F(xiàn)為現(xiàn)眼球震顫、頭傾斜或擺動(dòng)、轉(zhuǎn)圈、肢體偏癱或失平衡、肌陣攣甚至死亡。

頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱內(nèi)后與Willis環(huán)相連，Willis環(huán)上血管分支較多，包括大腦前動(dòng)脈及交通支、后動(dòng)脈及交通支、椎動(dòng)脈等。顱內(nèi)血管分布復(fù)雜，從頸內(nèi)動(dòng)脈注入栓子后，栓塞的部位目前一般認(rèn)為是大腦中動(dòng)脈，而且被許多檢測(cè)手段如數(shù)字減影血管造影（DSA）證實(shí)[11－12]，但國(guó)內(nèi)、外對(duì)為何會(huì)栓塞到同側(cè)大腦中動(dòng)脈而不栓塞到其他血管的現(xiàn)象尚無(wú)科學(xué)合理的解釋。為此，筆者結(jié)合實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、解剖學(xué)及流體力學(xué)提出了“對(duì)稱結(jié)構(gòu)與壓力平衡”設(shè)想：腦底部Willis環(huán)是左右對(duì)稱結(jié)構(gòu)，位于大腦前動(dòng)脈交通支中點(diǎn)及大腦后動(dòng)脈交通支中點(diǎn)，該處左右壓力相等，相互抵消，血流處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，即左右兩側(cè)血液互不流通。另外，大腦中動(dòng)脈血流分布供應(yīng)占大腦的2/3，占Willis環(huán)血流的絕大多數(shù)，即大腦中動(dòng)脈血流為優(yōu)勢(shì)血流。在這些前提下，當(dāng)頸內(nèi)動(dòng)脈栓子在等于或低于血壓值的壓力下進(jìn)入顱內(nèi)后，大多數(shù)血栓便隨優(yōu)勢(shì)血流進(jìn)入大腦中動(dòng)脈，而不會(huì)越過(guò)交通支進(jìn)入對(duì)側(cè)，進(jìn)入其他動(dòng)脈的幾率也較低。

巴曲酶是從蛇毒中提取的一種高純度類凝血酶樣物質(zhì)，由231個(gè)氨基酸組成,能增加纖溶酶原激活劑的釋放，降低提取血液中Fbg水平、降低血黏度、降低外周血管阻力，近年來(lái)廣泛用于治療缺血性腦血管疾病，治療急性腦梗死的療效肯定[13－14]。本研究結(jié)果表明，對(duì)于微血栓栓塞性腦中風(fēng)模型，巴曲酶可明顯提高 ES50值且能促進(jìn)t－PA釋放，這可能是其溶栓作用機(jī)制之一；同時(shí)也表明，該模型在評(píng)價(jià)腦梗死的溶栓、降纖等藥物方面科學(xué)、合理，結(jié)果可靠。

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