李立杰

吉林市麻疹病毒流行株M和N基因特征分析

李立杰

麻疹是兒童常見的一種急性傳染病，其傳染性很強，以皮丘疹、發(fā)熱及呼吸道癥狀為特征。我國自20世紀(jì)60年代初應(yīng)用減毒活疫苗以來，發(fā)病率顯著下降。但每年在全球仍有散發(fā)患者，并在一定范圍內(nèi)造成流行，引起死亡。麻疹病毒只有一種血清型，但近年對其基因的分析發(fā)現(xiàn)，麻疹病毒有8個基因組，23個基因型。在不同地區(qū)和時間流行株的基因型不同，通過對麻疹病毒基因型可以進(jìn)行病原學(xué)分析，判斷傳染源和傳播途徑。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源采集2007～2008年吉林市疑似麻疹患者出疹1～5 d內(nèi)咽拭12份和尿液6份，同時采集咽拭和尿液5份。咽拭采集后置于2～3 ml含2%小牛血清、終濃度為1000 U/ml的青霉素和鏈霉素、50U/ml制霉菌素的DMEM中標(biāo)本運輸液中，尿標(biāo)本采集10～50 ml，-20℃凍存。

1.2 總RNA提取及H、M基因的RT-PCR總RNA提取采用Trizol(Invitrogen，US)法。根據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心數(shù)據(jù)［1］和文獻(xiàn)［2］設(shè)計N和M基因引物如下。麻疹病毒核蛋白(N)基因引物:上游序列5’-ACTACAATCAGAGGTCAATTC-3’，下游序列5’-AGCATGTCTCCATTCGCAACT-3’，用于擴增N基因羧基末端的571bp的片段。麻疹病毒基質(zhì)蛋白(M)基因引物:上游序列5’-ACGCGTCGACAAAAAACTTA-3’，下游序列5’-ATCCGGGTCGTTTTCGGGCA-3’，用于擴增M基因中的188bp片段。RT-PCR使用大連寶生物TaKaRa RNA PCR kit(AMV)試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明取1μl麻疹病毒的RNA提取物作為模板合成cDNA，再PCR擴增所需的兩個(N和M)目的片段。每次同時取北京天壇生物制品股份有限公司生產(chǎn)的凍干麻疹活疫苗株長春-47(批號:2005081101)做陽性對照，取雙蒸水做陰性對照。

1.3 核酸序列的電泳、回收純化和鑒定將N、M基因片段PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。PCR的產(chǎn)物在紫外燈下切割，經(jīng)天為時代凝膠回收試劑盒回收和純化，送上海生工生物技術(shù)公司測序。

1.4 核酸序列分析采用SeqEd．V 1.0.3程序?qū)怂嵝蛄邢鄳?yīng)的氨基酸序列及基因差異進(jìn)行計算機分析。采用DNA STAR軟件MegAlign程序，對N和M基因片段的核酸序列做序列系統(tǒng)樹分析。

2 結(jié)果

2.1 麻疹病毒分離及鑒定結(jié)果本次從尿液標(biāo)本中分離到3株麻疹病毒，分離陽性率為16.67%;從咽拭標(biāo)本中分離到4株麻疹病毒，分離陽性率為22.22%。尿液標(biāo)本分離率低于咽拭標(biāo)本，但二者沒有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1、2。

2.2 RT-PCR結(jié)果，疫苗株和患者標(biāo)本均擴增得到約N基因600 bp、M基因200 bp核酸片段。陰性對照則無此片段。

2.3 對7個標(biāo)本的N基因450 bp的核酸序列與GenBank中的22個基因亞型做序列系統(tǒng)樹。2007年3個流行株之間同源性為99.8%，2008年4個流行株之間同源性為100%，即核酸序列完全相同，屬同一流行株，但不同于疫苗株長春-47。兩年之間流行株的差異率為0.4%。與世界其他22個麻疹病毒代表株的差異率為6.6%～10.9%。

3 討論

麻疹是一種傳播迅速、波及廣泛的傳染病。盡管麻疹病毒被認(rèn)為是單一血清型別，但是序列分析表明，存在著截然不同的麻疹野病毒基因型并共同在人類中傳播。從本次麻疹病毒基因序列的分析中可以看出，吉林市2007年分離得到的3株同源性99.8%，2008年分離得到的4株同源性100%。說明每年的流行均為同一傳染源引起，本流行期內(nèi)的麻疹病毒幾乎是同源的，在持續(xù)的人與人傳播的過程中幾乎不發(fā)生基因變異。

對麻疹病毒的全基因組序列研究表明，本次分離麻疹病毒流行株N基因1408處G→A，引起氨基酸改變G→S;1421處G→A，引起氨基酸改變A→D。這些氨基酸的變異可能直接影響到蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，從而可能引起抗原性變異，對病毒的抗原性影響程度尚需進(jìn)一步研究。本次對M基因相對易變序列的研究結(jié)果與國外報道相符合［3］。

雖然麻疹病毒基因分型沒有固定模式，但M、N基因分型基本一致［4］，分型均屬于H1基因型。根據(jù)序列分析和基因分型，雖然不能完全確定麻疹病毒株的地理起源，但可以更加準(zhǔn)確直觀的確認(rèn)不同流行期、不同地域的麻疹病毒株之間的關(guān)系，確定現(xiàn)流行的優(yōu)勢毒株，為麻疹病毒流行株的監(jiān)測和麻疹控制策略提供強有力的支持。

［1］Minimum N gene sequence(450 nucleotides)required for genotyping (sequence from Edmonston wildtype virus;codon start=1)．http://www．cdc．gov．

［2］WHO．Nomenclature for describing the genetic characteristics of wild-type measles viruses(Update)．WER，2001，76:241-247．

［3］Patterson JB，Cornu TI，Redwine J，et al．Evidence that the hypermutated M protein of a subacute sclerosing panencephalitis measles virus actively contributes to the chronic progressive CNS disease．Virology，2001，291(2):215-25．

［4］Michaela AR，Jennifer SR，Paul AR，et al．Review of the temporal and geographical distribution of measles virus genotypes in the prevaccine and postvaccine eras．Virol J，2005，2:87．

132021吉林省吉林市龍?zhí)秴^(qū)疾病預(yù)防控制中心

2.4 測定M基因的144 bp中，流行株均有4～11 bp不同于疫苗株CHANGCHUN-47，其中JL06-1株突變有意義，其有義突變有2處，3647 bp處G→T，引起氨基酸改變V→G;3680 bp處T→G，引起氨基酸改變Q→E。與GeneBank中能引起亞急性硬化性全腦炎(subacute sclerosing panencephalitis，SSPE)代表之間的關(guān)系。

圖2 麻疹野毒株在Vero/SLAM細(xì)胞上的病變

圖1 Vero/SLAM細(xì)胞