鄧建忠 金建華 陸文斌 王芳

江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇 常州 213002

Survivin于1997年由Ambrosini等［1］利用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-1(effector cell protease receptor-1，EPR-1)的cDNA在人類基因組庫中篩選克隆，具有抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期及參與血管形成的作用。胃癌因其早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者被確診時病程已至進(jìn)展期。檢測外周血中Survivin的表達(dá)，有可能成為檢測腫瘤轉(zhuǎn)移及判斷預(yù)后的參考指標(biāo)之一。本研究旨在探討外周血Survivin mRNA 的表達(dá)水平與胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用及臨床意義。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選擇2007年10月—2009年6月到江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院腫瘤科、消化內(nèi)科和外科就診并經(jīng)胃鏡活檢及術(shù)后病理確診為胃癌的患者50例(轉(zhuǎn)移28例，未轉(zhuǎn)移22例)，同時平行選擇年齡性別相匹配的門診慢性胃炎患者50例，所有患者均知情同意。

實(shí)驗(yàn)組病例為胃癌患者，共50例，其中男性28例(轉(zhuǎn)移16例，未轉(zhuǎn)移12例)，女性22例(轉(zhuǎn)移12例，未轉(zhuǎn)移10例)。年齡34～72歲(中位年齡58歲)。TNM分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期8例，Ⅲ期11例，Ⅳ期28例。采用2002年第6版AJCC胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。對照組病例為胃炎患者，共50例，其中男性30例，女性20例。年齡30～68歲(中位年齡54歲)。

1.2 方法

1.2.1 外周血總RNA的提取、完整性和純度檢測 根據(jù)試劑盒操作說明，應(yīng)用TRIzol Reagant行提取RNA，所提取的總RNA用紫外分光光度計(jì)定量并檢測其純度。A260/A280≥1.8為合格。所提取的總RNA完整性經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定。-70 ℃保存待用。

1.2.2 cDNA合成 20 μL反應(yīng)體系中含：總RNA 1 μg，10×緩沖液2 μL，dNTPs(10 mmol/L)2 μL，隨機(jī)引物100 ng，M-MLV(10 U/μL)2 μL，加DEPC液至20 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，-70 ℃保存待用。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測 利用DNAman軟件設(shè)計(jì)RT-PCR Survivin和管家基因GAPDH的引物：GAPDH上游引物為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，探針序列為5’-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3’；Survivin上游引物為5’-TGCCCCGACGTTGCC-3’，下游引物為5’-CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT-3’，探針序列為5’-CCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACC-3’。用RT-PCR法檢測患者外周血中Survivin mRNA的表達(dá)水平，GAPDH為內(nèi)參照，PCR試劑盒、引物及探針合成由中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因有限公司提供。50 μL RT-PCR反應(yīng)體系中含：1×定量緩沖液，200 μm dNTPs，5 UampliTaq Gold，Survivin上、下游引物各600 nmol/L，熒光探針200 nmol/L，100 ng cDNA，反應(yīng)條件為：50 ℃10 s，95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 30 s，60 ℃1 min，共40個循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線儀器自動進(jìn)行分析，對每份標(biāo)本均設(shè)副孔，采用GAPDH為內(nèi)參基因，以Survivin/GAPDH的比值計(jì)算出待測樣品的拷貝數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，生存曲線用Kaplan-Meier法建立，與生存時間的關(guān)系用Log-rank檢驗(yàn)。用Cox比例風(fēng)險模型評估影響預(yù)后生存的各變量。采用雙側(cè)檢驗(yàn)進(jìn)行處理，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Survivin mRNA檢測結(jié)果

正常對照組(胃炎患者)外周血中未檢測到Survivin mRNA表達(dá)。胃癌組患者Survivin表達(dá)檢測率為86%(43例)。其中28例轉(zhuǎn)移患者的陽性率為100%，22例未轉(zhuǎn)移的為68.2%(P<0.05)。

2.2 胃癌患者Survivin表達(dá)與臨床病理因素之間關(guān)系

與未轉(zhuǎn)移者相比較，有臟器轉(zhuǎn)移者Survivin mRNA表達(dá)明顯增高。Survivin mRNA表達(dá)與年齡、性別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性(P>0.05，表1)。

表1 Survivin表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)因素之間的關(guān)系Tab.1 The relationship between Survivin expression level and clinicopathologic features

2.3 預(yù)后因素分析

運(yùn)用COX回歸模型對可能影響胃癌患者預(yù)后的各種因素，包括年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Survivin表達(dá)及病理分期等進(jìn)行回歸分析。分析結(jié)果顯示：病理分期、Survivin mRNA的表達(dá)水平是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素(表2)。

表2 COX模型篩選的胃癌危險因素及其參數(shù)Tab.2 Multivariate analysis of prognostic factors by COX model

3 討 論

Survivin基因定位于染色體17q25，是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptotic protein，IAP)家族中的新成員，IAP家族的所有成員都具有一個共同的特征，即含有一個有1～3個拷貝的包括70個氨基酸殘基的桿狀病毒IAP重復(fù)序列(baculovims IAP repeat，BIR)，BIR功能區(qū)是發(fā)揮功能的主要結(jié)構(gòu)，IAP具有顯著的抑制細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)表明，Survivin可以與效應(yīng)細(xì)胞死亡蛋白酶caspase-3和caspase-7結(jié)合，抑制細(xì)胞凋亡，并抑制由Fas、Bax、抗癌藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［2］。胃癌是化療相對敏感的腫瘤，多種抗癌藥物治療腫瘤的原理是通過凋亡途徑導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，這提示凋亡抑制基因Survivin可作為胃癌患者對于化療是否敏感的指標(biāo)之一，從而指導(dǎo)腫瘤的個體化治療。Survivin基因在腫瘤研究領(lǐng)域備受關(guān)注：Survivin表達(dá)于胚胎和發(fā)育的胎兒組織，但較少表達(dá)于正常成人的終末分化組織。Survivin選擇性地在腫瘤中表達(dá)，目前已發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌、胃癌、食管癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中有Survivin的表達(dá)［3-6］。有研究表明Survivin在胃癌組織中100%表達(dá)。而在胃癌周圍正常組織中幾乎不表達(dá)［7］。但姚學(xué)權(quán)等［8］利用免疫組化SP法檢測Survivin在胃腺癌中的表達(dá)，結(jié)果顯示：胃癌原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞及正常腺體基底生發(fā)層細(xì)胞的Survivin的陽性表達(dá)率分別為49.2%、64.0%和17.5%。

目前國內(nèi)檢測Survivin常采用的是腫瘤組織及免疫組化的方法，而要對胃癌不同治療階段進(jìn)行監(jiān)測，了解化療時藥物對腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用，僅僅檢測胃癌組織中Survivin的表達(dá)是不夠的，需要采用新的途徑和更好的檢測方法。尋找敏感和特異的無創(chuàng)性方法監(jiān)測胃癌是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，外周血作為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的載體，是血行轉(zhuǎn)移的必要條件；實(shí)時熒光定量RT-PCR技術(shù)可以較準(zhǔn)確地檢測腫瘤患者外周血中腫瘤細(xì)胞的存在水平。

本研究顯示，正常對照組外周血未檢測到Survivin mRNA的表達(dá)。我們認(rèn)為可能是由于患者外周血中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量不足以促使Survivin表達(dá)，就被機(jī)體正常的免疫系統(tǒng)所抑制或消滅。而我們發(fā)現(xiàn)所有有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者Survivin均表達(dá)，能更好說明Survivin對抑制癌細(xì)胞凋亡的作用；在胃癌組患者中Survivin表達(dá)檢測率為86.0%，而那些早期或局部晚期的胃癌患者Survivin的表達(dá)率為68.2%，較Bertazza等［4］報道的98.6%低；兩者相比，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移胃癌患者的Survivin表達(dá)率明顯增高(P<0.05)。我們還對Survivin mRNA表達(dá)與年齡、性別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性作了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Survivin mRNA表達(dá)與這些臨床病理特征均無相關(guān)性(P>0.05)。以上結(jié)果表明隨著腫瘤病期的增加，Survivin表達(dá)水平升高，提示Survivin的表達(dá)在腫瘤的侵襲和血行轉(zhuǎn)移過程中起一定作用。本研究結(jié)果與Song等［9］的研究結(jié)果基本相似，僅腫塊大小的臨床病理特征與Survivin 表達(dá)有關(guān)，而與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性；但與Yie等［10］報道的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)及疾病分期與Survivin mRNA表達(dá)有關(guān)的研究結(jié)果不同。我們認(rèn)為這也可能是由于彼此所使用的檢測方法及入組的個體差異有關(guān)。

COX回歸模型對可能影響胃癌患者預(yù)后的因素進(jìn)行回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：腫瘤分期、Survivin mRNA的表達(dá)水平是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素，表明Survivin對胃癌的發(fā)生、發(fā)展影響顯著，且外周血Survivin的檢測可作為臨床評估胃癌患者預(yù)后的客觀指標(biāo)。

總之，實(shí)時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測腫瘤患者外周血中腫瘤細(xì)胞的水平是一種敏感而又特異的無創(chuàng)傷方法。Survivin作為新的凋亡抑制蛋白，對胃癌的發(fā)生、發(fā)展的影響重大。采用實(shí)時熒光定量RT-PCR法檢測胃癌外周血中Survivin mRNA表達(dá)水平，對胃癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的檢測和預(yù)后判斷具有一定價值。

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