宋傳貴 傅芳萌 吳雪英 林舜國 王川

福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院乳腺外科，福建 福州 350001

早發(fā)性乳腺癌(發(fā)病年齡≤35歲)屬于具有遺傳傾向的乳腺癌人群，易感性基因BRCA1或BRCA2基因的胚系突變只能解釋其中不足10%的人群［1］，其余的則涉及眾多低外顯易感基因位點［2］。PALB2(partner and localizer of BRCA2)基因為乳腺癌易感基因BRCA2細胞核內定位、轉移和穩(wěn)定的協(xié)同因子，可促進BRCA2的DNA修復功能和細胞周期調控，從而保持基因組穩(wěn)定性［3］。有研究表明，PALB2基因的胚系突變不但增加西方人群的乳腺癌發(fā)病風險［4］，而且，其部分單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點可以影響散發(fā)性乳腺癌的易感性［5-6］。本研究以福建地區(qū)早發(fā)性乳腺癌為研究對象，探討PALB2 rs249954、rs447529及rs16940342多態(tài)性位點的分布及是否可將其作為乳腺癌的低外顯率易感基因位點的可能性。

1 資料和方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選擇福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院2006年1月—2010年6月無血緣關系的原發(fā)性乳腺癌患者共124例(病例組)，全部經組織病理證實，家族史狀況由病史或調查表獲得并最后經本人證實。病例組均為單純早發(fā)性乳腺癌患者，無明顯家族史，入組患者年齡21～35歲，中位年齡32歲，平均初潮年齡(15±1.5)歲；取101例健康女性為對照組，年齡20～39歲，中位年齡33歲，平均初潮年齡(14±1.6)歲，按年齡與病例組研究對象配對(年齡±4歲)入組。

1.1.2 標本及DNA提取 獲得患者知情同意后，抽取外周靜脈血5 mL置于含800 μL酸性枸櫞酸葡萄糖(ACD)抗凝液的試管中備用。

1.1.3 主要試劑和儀器 FlexiGene DNA提取試劑盒(美國Qiagen公司)，GeneAmp?9700 PCR系統(tǒng)(美國ABI公司)，HotStar Taq聚合酶(5 U/μL)及試劑盒(美國Qiagen公司)，MassARRAY Analyzer(美國Sequenom公司)。

1.2 方法

1.2.1 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/Ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)法［7-8］此實驗與深圳華大基因組研究中心合作完成。⑴DNA提?。簭耐庵苎崛』蚪MDNA，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。⑵PCR擴增：引物根據oligo-4.0-s軟件設計，如表1中所示。PCR的反應體系總體積為5 μL，其中各種引物濃度為0.1 μmol/L，各種dNTP濃度為0.25 μmol/L，MgCl2濃度為1 mmol/L，Taq多聚酶1.25 U，DNA模板2.5 ng。PCR 反應的條件為95 ℃預變性15 min；94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，45個循環(huán)；72 ℃延伸3 min，然后4 ℃保存。隨后純化PCR產物進行延伸反應。延伸反應體系總體積9 μL，PCR純化產物7 μL，延伸混合液2 μL 。反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性5 min，52 ℃退火5 min，72 ℃延伸5 min，55個循環(huán)；72 ℃延伸3 min，產物于4 ℃保存。每個延伸反應用3 mg Clean Resin樹脂純化后于384孔Spectrometry chip芯片上點樣。使用MassARRAY YTM Analyzer進行質譜檢測。

1.2.2 基因型的判斷 各樣本經PCR反應及質譜檢測，運行MassARRAY Typer 3.0.1軟件進行數據分析，并輸出各樣本相應位點的基因型。各位點的代表性圖譜見圖1。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用χ2檢驗進行各基因型和等位基因頻率在病例組和對照組間的分布差異比較以及Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的吻合度檢驗；兩組間的流行病學資料均數比較采用t檢驗；相對危險度采用比值比(odd ratio，OR)和95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)并應用非條件Logistic回歸分析計算，并對混雜因素進行校正。所有統(tǒng)計采用雙側概率檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；SPSS 17.0用于統(tǒng)計分析。

表1 各基因多態(tài)性(SNP)引物信息Tab.1 Primers designed for SNP genotyping

2 結 果

2.1 兩組流行病學特征比較

病例組中位年齡小于對照組(P=0.023)，對照組初潮年齡小于病例組的初潮年齡(P=0.00)，說明計算OR時需要予以校正。

2.2 基因型鑒定

PALB2基因rs249954、rs447529及rs16940342的各基因型經MALDI-TOF-MS分析鑒定，結果124例患者和101例健康女性成功進行分型(圖1)。

2.3 PALB2基因3個SNP分布

對照組PALB2基因rs249954 CC、CT及TT基因型的頻率分別為36(35.6%)、49(48.5%)和16(15.8%)；rs447529 CC，CG及GG基因型的頻率分別為3(3.0%)、28(27.7%)和70(69.3%)；rs16940342 AA，GA及GG基因型的頻率分別為59(58.4%)、37(36.6%)和5(5.0%)；經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，均符合遺傳平衡(P>0.05)，表明其具有群體代表性(表2)。病例組PALB2基因rs249954 CC、CT及TT基因型的頻率分別為53(42.7%)、53(42.7%)和18(14.5%)，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.554)；rs447529 CC、CG、GG基因型的頻率及rs16940342 AA，GA及GG基因型的頻率，兩組差異也無統(tǒng)計學意義(P=0.841，P=0.312，表3)。

表2 PALB2 多態(tài)性各基因型的HWE平衡Tab.2 Hardy-Weinberg equilibrium calculation for SNP of PALB2 gene

2.4 3種SNP基因型與乳腺癌發(fā)病風險的關系

分別以rs249954 CC、rs447529 CC、rs16940342 AA基因型為參照，非條件Logistic回歸分析結果提示，各多態(tài)性位點未顯著性降低患乳腺癌的發(fā)病危險(P>0.05，表3)。

3 討 論

圖1 PALB2三個基因多態(tài)性基因分型圖Fig.1 Representative MALDI-TOF-MS profiles of three polymorphisms genotype of PALB2 gene

表3 PALB2 三個多態(tài)性基因型分布及其與乳腺癌發(fā)病風險的關系Tab.3 Genotype distribution of three polymorphisms of PALB2 gene and their association with risk of breast cancer[n(%)]

PALB2基因通過和BRCA2基因協(xié)同作用而發(fā)揮抑癌基因的功能，本研究對PALB2基因的多態(tài)性位點rs249954、rs447529、rs16940342與早發(fā)性乳腺癌的發(fā)病風險關系進行了病例對照研究。結果發(fā)現，各遺傳多態(tài)性位點與乳腺癌的發(fā)病風險無明顯的相關性。在中國人群進行的散發(fā)性乳腺癌研究中，Chen等［5］在江蘇人群中發(fā)現PALB2基因的rs249954和rs16940342都增加總體人群乳腺癌的發(fā)病風險，OR達1.21～1.36；而在上海人群的研究中，Cao等［6］認為PALB2基因 rs447529的含G基因型降低了患乳腺癌的風險，而rs249954和rs16940342基因型則對乳腺癌發(fā)病風險無顯著影響。我們的研究與上述的研究不同之處在于⑴患者群不同：本研究對象是早發(fā)性乳腺癌，與散發(fā)性乳腺癌相比，更能代表人群的遺傳傾向特征并體現易感基因的影響。⑵人群地域不同：本研究人群來自福建地區(qū)，與來自長江下游的江蘇、上海人群有所不同，可能代表了不同地域的流行病學特征。⑶研究人群數不同：本研究的例數比散發(fā)乳腺癌人群少，可能存在選擇性偏移，由于研究對象為具有遺傳傾向的乳腺癌，所以該缺陷得到了一定程度的彌補。本研究與Cao等［6］的研究結果相同的是rs249954和rs16940342基因型與乳腺癌的發(fā)病無明顯相關性，表明不管是散發(fā)性乳腺癌還是具有遺傳傾向的早發(fā)性乳腺癌人群，rs249954和rs16940342的影響是微弱的。

PALB2基因rs249954、rs447529和rs16940342等多態(tài)性位點都位于基因序列的內含子區(qū)域，并未影響基因的轉錄過程，其實際的生物學功能和遺傳學效應尚不明確；另外其影響是否被潛在的其他未鑒定的位點或潛在易感基因所掩蓋，尚需考證?？傊覀冋J為，PALB2基因多態(tài)性在福建漢族人群中有其自身的分布特點，可能與福建地區(qū)早發(fā)性乳腺癌(≤35歲)的遺傳易感性無明顯關聯(lián)，尚不能作為低外顯率的乳腺癌易感基因位點。明確PALB2基因遺傳多態(tài)性位點在中國人群中的確切作用，還需要更大樣本的遺傳傾向乳腺癌的流行病學研究。

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