田榮華 應韶旭 李曉 黃華

1.上海交通大學醫(yī)學院附屬上海市第六人民醫(yī)院血液科，上海 200233；2.南通大學附屬海安醫(yī)院血液科，江蘇 南通 226600；3.南通大學附屬醫(yī)院病理科，江蘇 南通 226000

彌漫大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）中最普通的一種類型，大約占新診斷患者的30%～40%，是一種具有侵襲性、生長迅速并具有臨床異質(zhì)性的中-高度惡性淋巴瘤［1］?；颊叩念A后當前主要依靠5個簡單的臨床變量組成的國際預后指數(shù)（inter-national prognostic index，IPI），但其中沒有一個與淋巴瘤生物學相關的變量［2］。到目前為止也沒有一個與淋巴瘤生物學相關的預后標志得到公認。cDNA和寡核苷酸微陣列的基因表達經(jīng)常用來篩選患者的預后因子［3］，但是這個技術費用昂貴且臨床應用不方便，因此免疫組化方法經(jīng)常被用來檢測與預后相關基因的蛋白水平。

Pim1基因最早是作為莫洛尼小鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MoMuLV）的前病毒插入點而被發(fā)現(xiàn)的，它可以促進小鼠的淋巴瘤的形成［4］。Pim1作為一種原癌基因，在調(diào)控細胞凋亡、分化、增殖以及腫瘤形成等方面發(fā)揮了非常重要的作用［5］。有研究顯示：Pim1基因由于體細胞高頻突變而導致其高表達，也有研究表明是染色體異位導致其高表達［6-7］，但其與預后的關系目前仍不能確定。因此，我們的研究目的是通過免疫組化的方法評價PIM1蛋白的表達與DLBCL預后的關系。

1 資料和方法

1.1 資料 收集上海交通大學醫(yī)學院附屬上海市第六人民醫(yī)院和南通大學附屬醫(yī)院2002年1月—2006年2月確診的初發(fā)淋巴結(jié)起源的DLBCL患者53例進行回顧性分析，其中18例患者來自前者，35例患者來自后者。本實驗之前所有患者的病理切片均請2位病理科醫(yī)生復核過。所有病例都接受了6～8個周期的CHOP方案化療，15例患者在化療后淋巴結(jié)消退不滿意的情況下接受了放療，但病例均未接受利妥昔單抗治療，不適合的病例均未入選。53例患者中，男性患者29例，女性患者24例，患者平均年齡55歲（范圍12～79歲），平均隨訪時間32個月（1～86個月）。對53例患者進行了Ann Arbor臨床分期，其中Ⅰ/Ⅱ期27例，Ⅲ/Ⅳ期26例。與預后相關的IPI取決于年齡、體能狀況、血清乳酸脫氫酶水平（lactate dehydrogenase，LDH）、結(jié)外病變的數(shù)量、疾病分期這5個臨床變量［2］。根據(jù)IPI評分分為低危（0～2分）25例和高危（3～5分）28例，患者的具體資料見表1。

1.2 主要試劑 一抗兔抗人PIM1單克隆抗體為Epitomics，為Inc公司產(chǎn)品，一抗兔抗人CD10、BCL6、MUM1單克隆抗體為Dako公司產(chǎn)品，二抗EnVisionTM系統(tǒng)為Dako公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法 免疫組織化學EnVision通用型二步法，步驟如下：⑴切片烘片；⑵二甲苯脫蠟；⑶乙醇溶液逐級水化；⑷3%的過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；⑸抗原微波修復；⑹滴加合適的一抗，置切片于濕盒內(nèi)，室溫靜置45 min；⑺滴加EnVision二抗一酶標多聚物，37 ℃放置30 min；⑻滴加0.04%DAB顯色液。PIM1、CD10、BCL6和MUM1抗體工作液稀釋度為l∶100。以反應性增生的扁桃體作為對照，PIM1抗體著色于扁桃體的上皮和血管內(nèi)皮及生發(fā)中心的幼稚細胞作為陽性對照，而濾泡周圍的成熟的小淋巴細胞不著色作為陰性對照（圖1）。

表1 PIM的表達及患者的臨床特征Tab.1 PIM1 and characteristics of patients with DLBCL

1.4 結(jié)果判斷 PIM1抗體著色于細胞核視為陽性，免疫組化結(jié)果以500個淋巴瘤細胞計數(shù)陽性比，陽性病例是指抗體著色≥30%的淋巴瘤細胞。生發(fā)中心和非生發(fā)中心以CD10、BCL6、MUM1三個抗體區(qū)分，具體標準按照Hans等［8］的方法。若切片著色不均，以陽性細胞比例較高區(qū)域進行分析，以上結(jié)果由上海交通大學醫(yī)學院附屬上海市第六人民醫(yī)院病理科和南通大學附屬醫(yī)院病理科醫(yī)生在雙盲情況下觀察所得。比較臨床參數(shù)和PIM1的表達時，我們把這個PIM1的持續(xù)性變量轉(zhuǎn)換為二分類變量，≥30%的腫瘤細胞著色定義為高表達，<30%的腫瘤細胞著色定義為低表達［9］。

1.5 療效評價標準 客觀療效評定標準按我國實體瘤客觀近期療效評定標準［10］。

1.6 隨訪 所有入選病例臨床資料均齊全并可以電話隨訪，對全部病例以電話形式進行追訪，所有患者隨訪至2009年8月，電話隨訪的內(nèi)容包括患者一般狀況，以前治療的情況，近期復查情況。隨訪期內(nèi)28例患者死亡，13例患者一直處于緩解中。生存期為病理確診之日至死亡或最后隨訪時間。

1.7 統(tǒng)計處理 SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析處理，分類變量用Fisher’s檢驗，數(shù)值變量用Mann-Whitney檢驗，生存曲線用Kaplan-Meier分析和比較用Log-rank法，Logistic回歸和Cox回歸模型分析用于評價pim1和IPI對總生存和化療緩解率的影響。所有的檢驗以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義?？偵妫╫verall survival，OS）指從確診到死亡或上次接觸（指沒有死亡的病例上次電話隨訪的時間）之間的時間。

2 結(jié) 果

2.1 PIM1在DLBCL中的表達 PIM1著色于細胞核，腫瘤細胞著色比例為0%～100%，平均值為30%。在我們的實驗中，所有病例細胞核均著色，在24例（45.2%）PIM1高表達患者中，有5例合并細胞質(zhì)著色（圖1）。PIM1高表達在年齡、性別、LDH水平、分期、B癥狀之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），在其他方面存在差異（P<0.05，表1）。

2.2 PIM1的表達與生發(fā)中心表型 根據(jù)生發(fā)中心的標志，有25例是生發(fā)中心起源，其余是非生發(fā)中心起源，PIM1的高表達在生發(fā)中心起源的淋巴瘤和非生發(fā)中心起源的淋巴瘤兩組之間存在差異（P=0.005）。

2.3 PIM1的表達與化療的完全緩解率 所有53例患者全部接受了6～8個周期的CHOP方案化療，均可評估化療的反應性。27例（50.9%）患者獲得了完全緩解，但其中有14例（51.9%）患者在隨訪期內(nèi)復發(fā)，其余13例患者在隨訪期末一直處于完全緩解中。部分緩解和沒有緩解的患者分別是19例（35.8%）和7例（13.3%）。PIM1高表達的患者的完全緩解率為29.2%，PIM1低表達的患者的完全緩解率為68.9%（P=0.006）。沒有完全緩解的患者比完全緩解的患者具有更高的PIM1的表達（65.4% vs 25.9%），PIM1的表達與復發(fā)沒有關系。我們對PIM1的表達和IPI分期進行了Logistic回歸分析。在單因素回歸中顯示PIM1高表達的完全緩解率的OR=0.263（95%CI：0.084～0.825，P=0.022），高IPI組OR=0.184（95%CI：0.057～0.559，P=0.005）；在包括PIM1和IPI的多因素回歸中，PIM1高表達的完全緩解率的OR=0.374（95%CI：0.110～1.278，P=0.117），高IPI組OR=0.235（95%CI：0.069～0.801，P=0.021）。

2.4 PIM1的表達與患者的總生存 在隨訪期內(nèi)28例患者死亡，平均生存時間14個月（1～30個月），3年的總生存率為47.2%。Kaplan-Meier分析顯示：PIM1高表達組3年總生存率為29.2%，PIM1低表達組為62.1%；高IPI組3年總生存率為25.0%，低IPI組為72.0%（圖2）。PIM1高表達組3年總生存率比PIM1低表達組低（P<0.001），在高IPI組和低IPI組間的差異也有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。單因素COX回歸分析表明，PIM1高表達組RR=3.755（95%CI：1.684～8.375，P<0.001）；IPI的RR=3.978（95%CI：1.681～9.413，P=0.002）。在包括PIM1和IPI的多因素Cox回歸分析表明，PIM1高表達組RR=2.756（95%CI：1.197～6.347，P=0.017）；高IPI組RR=2.947（95%CI：1.203～7.219，P=0.018）。

3 討 論

在本研究中，我們檢測了PIM1在一組原發(fā)性結(jié)節(jié)性DLBCL中的表達，PIM1高表達的患者生存期更短、化療緩解率較低。雖然PIM1的表達也與其他一些與預后相關的因素有關，如生發(fā)中心表型和IPI，但是多因素分析顯示，PIM1的表達與IPI不相關。因此，我們的實驗結(jié)果提示PIM1高表達是DLBCL的一個獨立的預后不良標志。

在我們的研究中，PIM1的高表達在單因素回歸分析中是化療完全緩解率的負性預后標志，但在PIM1和IPI多因素分析中并沒有意義。我們通過共線性診斷沒有發(fā)現(xiàn)PIM1和IPI之間存在共線性（VIF=1.121，TOL=0.892），因此我們得出多因素回歸中沒有意義，可能是與我們的樣本量小有關。我們推斷PIM1的高表達與化療的完全緩解率可能相關，但需要更大樣本含量的實驗證實我們的推斷。

據(jù)我們所知，本實驗是第一次檢測PIM1的表達與DLBCL預后的關系。雖然基因表達研究顯示：Pim1在某些DLBCL的亞群中與預后相關，但是關于PIM1蛋白與DLBCL的預后的關系尚不清楚。Pasqualucci等［6］研究發(fā)現(xiàn)：Pim1是體細胞高頻突變的靶點，在50%的非免疫缺陷的DLBCL中可以檢測到Pim1基因突變。Akasaka等［7］研究表明：染色體異位導致PIM1的高表達，在一些大B細胞淋巴瘤的發(fā)生中可能起著重要的作用。Sivertsen等［11］和Hoefnagel等［12］在基因水平的研究顯示：一些亞型的大B細胞淋巴瘤和皮膚起源的DLBCL中，PIM1的高表達可能與患者預后相關，且PIM1的高表達與非生發(fā)中心起源的淋巴瘤相關。在我們的實驗中，24例PIM1高表達的患者有18例屬于非生發(fā)中心起源（r=0.404，P=0.003），證實了他們的相關研究結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)PIM1高表達在單因素和多因素Cox分析均顯示是總生存的獨立的預后因素。因此，我們的實驗結(jié)果從PIM1蛋白水平證實了上面這些Pim1基因水平的研究結(jié)果。

PIM1蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以磷酸化許多底物導致相應的生物學功能，主要涉及細胞信號的轉(zhuǎn)導、細胞周期調(diào)節(jié)、促進生存抑制凋亡，因此在腫瘤發(fā)生過程中起著重要的作用［13］。雖然Pim1促進細胞轉(zhuǎn)化的機制沒有完全闡明，但一些研究顯示它有促進細胞生存的作用［13-14］。最近研究發(fā)現(xiàn)的Pim1的底物Bad，是一種促凋亡蛋白，PIM1可以磷酸化Bad的112位的絲氨酸，而該位點是Bad失活的控制點［13］。非磷酸化的Bad可與Bcl-2結(jié)合形成異源二聚體，拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用，而PIM1磷酸化Bad后使其失活，導致細胞生存與凋亡的平衡被打破，因此促進轉(zhuǎn)化細胞的生存［15-17］。根據(jù)我們的實驗結(jié)果PIM1與患者的負性預后相關可能與PIM1磷酸化相應的促凋亡蛋白，導致腫瘤細胞凋亡低下有關。

總之，在DLBCL患者中，PIM1高表達與化療反應性低和總生存短相關。但我們的實驗樣本量較小，因此要經(jīng)過大樣本和不同人群的研究來進一步證實我們的發(fā)現(xiàn)，PIM1才有可能成為DLBCL的預后標志。

另外，PIM1具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的特性和在腫瘤的形成中具有多樣的生物學作用，使得PIM1可以成為一種治療的靶點［18］。

致謝 衷心感謝上海交通大學醫(yī)學院附屬上海市第六人民醫(yī)院病理科張惠箴主任及病理科其他老師和南通大學附屬醫(yī)院病理科老師為我們實驗提供的幫助。

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