許惠敏，郭紅云，張桂瓊，黃邦榮，張永東，梁 濤，李雪萍，胡清榮，王玉梅

（甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥理毒理實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州 730050）

扶正升血顆粒對荷瘤小鼠NKC-IFN-IL-2免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)的影響

許惠敏，郭紅云，張桂瓊，黃邦榮，張永東，梁 濤，李雪萍，胡清榮，王玉梅

（甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥理毒理實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州 730050）

目的 探討扶正升血顆粒對荷瘤小鼠NKC-IFN-IL-2免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)的影響。方法 建立小鼠移植性肝癌（H22）模型，將小鼠隨機(jī)分為5組，分別為扶正升血顆粒低、中、高劑量組，陽性對照組和模型對照組，同時(shí)設(shè)正常對照組。經(jīng)口灌胃給藥10 d，采用乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn)測定NK細(xì)胞活性；用雙抗體夾心ELISA法測定脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2和IFN-r的濃度。結(jié)果 扶正升血顆?？稍鰪?qiáng)荷瘤小鼠NK細(xì)胞的活性，同時(shí)提高IL-2和IFN-r的水平。結(jié)論 扶正升血顆粒對NKCIFN-IL-2免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)可起到正向調(diào)節(jié)作用。

扶正升血顆粒；荷瘤小鼠；NKC-IFN-IL-2免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)

近幾年,國內(nèi)外在單味藥和其所含的單體成分的免疫調(diào)節(jié)作用方面研究較多[1]，而對復(fù)方研究較少。但是復(fù)方的復(fù)雜成分具有單味藥和單體成分所不具備的藥效整體性和互補(bǔ)作用，其可使療效增強(qiáng)，毒副作用減少。扶正升血顆粒是我國著名中西醫(yī)結(jié)合專家裴教授擬定的臨床驗(yàn)方之一，該方經(jīng)30余年的不斷實(shí)踐，顯示出較好的療效。本研究應(yīng)用現(xiàn)代藥理學(xué)研究方法探討扶正升血顆粒對荷瘤小鼠NK細(xì)胞和細(xì)胞因子的影響，闡釋其對荷瘤小鼠NKC-IFN-IL-2免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)的作用，為今后其在腫瘤的治療方面以及進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

扶正升血顆粒，由人參須、北沙參、太子參、潞黨參等組成,由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院提供,每包含生藥36.25 g。貞芪扶正升血顆粒，由定西制藥廠生產(chǎn)；硝基氯化四氮唑藍(lán)（NBT）、氧化型輔酶 I、吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）、刀豆蛋白 A（ConA）、脂多糖LPS均為Sigma公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)液為美國GIBCO產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞分離液由天津生物技術(shù)開發(fā)中心生產(chǎn)；小鼠IL-2 ELISA試劑盒、小鼠IFN-r ELISA試劑盒由北京晶美生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c小鼠，SPF級，雌雄兼有，體重18～20 g，購自甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號為SCXK（甘）2006-0010。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境：溫度為20℃～22℃，相對濕度為40%～50%，環(huán)境設(shè)施合格證號為SYXK[甘]2006-0010號。

1.3 瘤株

小鼠移植性肝癌（H22）瘤株,小鼠淋巴瘤（YAC-1）細(xì)胞株，由北京藥物所引進(jìn)，甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥理毒理實(shí)驗(yàn)中心保種。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

SW-CJ-IF生物凈化工作臺(tái)（蘇州）、SHEL-LAB1825TCCO2培養(yǎng)箱（美國）、TDL5M臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī)（長沙）、Multiskan MK3酶標(biāo)儀（Themo Labsystems）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 腫瘤模型建立[2]取接種肝癌（H22）瘤株7～8 d小鼠的腹水,用生理鹽水稀釋，臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)，將活細(xì)胞數(shù)調(diào)至2×106/ml左右的瘤細(xì)胞懸液接種在小鼠右腋皮下,每只接種0.2 ml。

1.5.2 分組及給藥方法 接種次日將小鼠分為5組，分別為扶正升血顆粒低劑量組2.5 g/kg（相當(dāng)于人臨床用量的5倍，低劑量組）、扶正升血顆粒中劑量組5.0 g/kg（相當(dāng)于人臨床用量的10倍，中劑量組）、扶正升血顆粒高劑量組10.0 g/kg（相當(dāng)于人臨床用量的20倍，高劑量組）、模型對照組和陽性對照組（給予貞芪扶正顆粒1.7 g/kg，相當(dāng)于人臨床用量的10倍），同時(shí)設(shè)正常對照組。每組小鼠8只，雌雄各半。接種次日按設(shè)定劑量開始給藥,各治療組灌胃給予0.2 ml/10 g體重的藥物，模型對照組和正常對照組給予等容量的蒸餾水，每日1次，連續(xù)給藥10 d。

1.5.3 NK細(xì)胞活性測定[3]小鼠接種、分組及給藥方法同上。末次給藥后1 h，放血處死小鼠，無菌取脾，放入PBS液中涮洗后，用載玻片輕輕捻碎，吸取3 mlPBS液沖洗載玻片，用濾網(wǎng)（200目）過濾至小青瓶中，再將其沿管壁緩緩轉(zhuǎn)入預(yù)先裝入3 ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中離心（4℃ 3000 rpm，20 min）,吸取淋巴細(xì)胞分離液層細(xì)胞至離心管中，加PBS液洗2次，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度至1×107/ml。實(shí)驗(yàn)前24 h將靶細(xì)胞YAC-1進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用前以Hank’s液洗3次，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度至4×105/ml。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100μl(效靶比50：1)，加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中；靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100μl，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和2.5%Triton-100各100μl，上述各項(xiàng)均設(shè)3個(gè)平行孔，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，然后將96孔培養(yǎng)板以1500 r/min離心5 min，每孔吸取上清液100μl置96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100μl，室溫反應(yīng)3～10 min，每孔加入1 mol/L的HCl30μl，于酶標(biāo)儀490 nm處測定光密度值（OD），按下式計(jì)算NK細(xì)胞活性。NK細(xì)胞活性（%）=（反應(yīng)孔OD-自然釋放孔OD）（/最大釋放孔OD-自然釋放孔OD）×100%。

1.5.4 脾淋巴細(xì)胞IL-2和IFN-r的誘生與測定 小鼠接種、分組及給藥方法同上。取上述方法制備的脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度至1×107/ml，加入48孔板中，每孔0.9 ml，同時(shí)每孔加入含ConA的培養(yǎng)液100μ（lConA的終濃度為5μg/ml），置37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，收集上清液，按小鼠IL-2 ELISA試劑盒說明操作進(jìn)行測定。另取上述制備的脾淋巴細(xì)胞懸液，加入48孔板中，每孔1 ml，同時(shí)加入終濃度為5μg/ml的LPS，置37℃ 含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集上清液，按小鼠IFN-r ELISA試劑盒說明操作進(jìn)行測定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 扶正升血顆粒對荷瘤小鼠脾NK細(xì)胞活性的影響（見表1）

表1 扶正升血顆粒對荷瘤小鼠脾NK細(xì)胞活性的影響（n=8±s）

表1 扶正升血顆粒對荷瘤小鼠脾NK細(xì)胞活性的影響（n=8±s）

注：與正常對照組比較，▲P<0.05；與模型對照組比較，*P<0.05

2.55.010.01.7組 別 劑量（g/kg） NK細(xì)胞活性（%）正常對照組模型對照組扶正升血顆粒低劑量組扶正升血顆粒中劑量組扶正升血顆粒高劑量組陽性對照組--36.2±3.119.7±2.2▲22.2±4.0▲24.3±3.3▲*25.0±3.2▲*25.9±2.5▲*

模型對照組小鼠脾NK細(xì)胞活性明顯低于正常對照組。各治療組小鼠脾NK細(xì)胞活性較模型對照組均有所提高，扶正升血顆粒高、中劑量組與模型對照組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 扶正升血顆粒對荷瘤小鼠脾細(xì)胞IL-2和IFN-r的影響（見表2）

表2 扶正升血顆粒對荷瘤小鼠脾細(xì)胞IL-2和IFN-r的影響（n=8±s）

表2 扶正升血顆粒對荷瘤小鼠脾細(xì)胞IL-2和IFN-r的影響（n=8±s）

注：與正常對照組比較，▲P<0.05，與模型對照組比較，*P<0.05

?

模型對照組小鼠IL-2和IFN-r的量明顯低于正常對照組。各治療組小鼠IL-2和IFN-r的量較模型對照組均有所提高，扶正升血顆粒高劑量組IL-2的量與模型對照組比較，有顯著性差異（P＜0.05），扶正升血顆粒高、中劑量組IFN-r的量與模型對照組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。

3 討論

機(jī)體抗腫瘤的免疫機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多種免疫成分。細(xì)胞因子是由活化的免疫細(xì)胞和一些基質(zhì)細(xì)胞分泌的小分子蛋白。細(xì)胞因子本身就是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，在免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、傳遞和調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)控作用，很多中藥都能促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌[4]。在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中，免疫細(xì)胞之間、免疫分子之間、免疫細(xì)胞與免疫分子之間相互影響，彼此調(diào)節(jié)，構(gòu)成了精細(xì)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，共同維持機(jī)體的免疫平衡和自身穩(wěn)定。有文獻(xiàn)報(bào)道[5]，NKC-IFN-IL-2免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)當(dāng)數(shù)重要網(wǎng)絡(luò)之一，并與MФ-IL-1-Th1免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)密切相關(guān)。在NKC-IFN-IL-2免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)中，IL-2對調(diào)節(jié)NKC活性和IFN-r的產(chǎn)生起著重要作用。NKC表面有IL-2受體（IL-2R），在絲裂原或抗原誘導(dǎo)下TH分泌的IL-2與NK細(xì)胞上的IL-2R結(jié)合，促進(jìn)NKC分泌IFN-r，并使之繼續(xù)分裂增殖。IFN-r又可作用于NK細(xì)胞的前體細(xì)胞使之合成和表達(dá)IL-2R，從而接受IL-2的作用而繼續(xù)增殖。IL-2和IFN-r除可使更多的NK細(xì)胞激活外，還可參與T細(xì)胞、B細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答過程。因此，NKC-IFN-IL-2免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)具有十分廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用。腫瘤患者產(chǎn)生IL-2的能力低下，并伴隨著IFN-r的產(chǎn)生減少和NK細(xì)胞活性的降低，可見NKC-IFN-IL-2免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)與腫瘤密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，荷瘤小鼠NK細(xì)胞活性降低，同時(shí)產(chǎn)生IL-2和IFN-r的能力低下，而扶正升血顆?？稍鰪?qiáng)荷瘤小鼠NK細(xì)胞的活性，同時(shí)提高IL-2和IFN-r水平，表明扶正升血顆粒對NKC-IFN-IL-2網(wǎng)絡(luò)可起到正向調(diào)節(jié)作用，為其抗腫瘤效應(yīng)奠定了理論基礎(chǔ)。

[1]張群，雷林生，關(guān)曙光.糖類藥物作用的受體及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中草藥，2005，36（4）：614～616.

[2]徐叔云，卞如廉，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002.

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003年版）[S].2003.

[4]何躍生.中草藥免疫調(diào)節(jié)劑及抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].職業(yè)與健康,2005，21（10）：1454～1456.

[5]賀懷新，席孝賢.中醫(yī)藥免疫學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2002.

G424.31

B

1671-1246（2010）16-0081-02

甘肅省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目（2006-17）