吳小建,黃芳媚,王 勇

(九江學(xué)院附屬醫(yī)院血液腫瘤科,江西 九江 332000)

迄今為止,骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,近年來(lái)大量研究認(rèn)為MDS的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸不僅與造血細(xì)胞異常有關(guān)[1],同時(shí)與抗腫瘤免疫缺陷有關(guān)[2],免疫異常在MDS的發(fā)生、發(fā)展中起到了促進(jìn)作用。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)和調(diào)控基因FOXP3是近10年來(lái)關(guān)于機(jī)體免疫狀態(tài)的研究熱點(diǎn),與機(jī)體的免疫狀態(tài)有著密切的關(guān)系。本研究通過(guò)檢測(cè)MDS患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞和FOXP3基因表達(dá)量,探討二者在MDS疾病中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

1) 選擇2006年3月-2008年12月九江學(xué)院附屬醫(yī)院血液腫瘤科收治的 MDS患者(MDS組)22例,均符合MDS診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。其中男14例,女8例;年齡17～81歲,中位年齡45歲。根據(jù)MDS分型標(biāo)準(zhǔn)[3]將22例患者分為:難治性貧血組(RA組)6例、難治性血細(xì)胞減少伴有多系發(fā)育異常組(RCMD組)11例、難治性貧血伴原始細(xì)胞增多組(RAEB組)5例。

2) 選擇同期正常健康人(正常對(duì)照組)8例,男4例,女 4例;年齡25～67歲,中位年齡39歲。均為健康志愿者。

3) 各組均采集骨髓液4 mL,EDTA抗凝。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol試劑盒、TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR GREEN熒光染料均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;流式試劑 PE-CY5-CD4、FITC-CD25、同型對(duì)照FITC-Mouse IgG均購(gòu)自美國(guó)BD公司。Epics XL型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司),iCycler iQTM熒光實(shí)時(shí)PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司),Lamba 20型雙光束紫外分光光度計(jì)(美國(guó) PE公司)。

1.3 方法

1) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例:取EDTA抗凝的骨髓液1 mL,2倍體積PBS稀釋,用淋巴細(xì)胞分離液分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至1×107/mL。各取骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液50μL于標(biāo)本試管中,分別加入 PE-CY5-CD4 和 FITC-CD25各 5μL;陰性對(duì)照管中加入PE-CY5-CD4和FITC-Mouse IgG1各5μL,振蕩混勻后,室溫避光孵育30 min后重新懸浮細(xì)胞上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每份標(biāo)本測(cè)定10000個(gè)細(xì)胞,全部數(shù)據(jù)用流式細(xì)胞儀軟件SYSTEMⅡ獲取,測(cè)定CD4+CD25+T reg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞亞群的百分率。

2) RT-PCR法檢測(cè)FOXP3基因的表達(dá):①骨髓單個(gè)核細(xì)胞總RNA的提取:按Trizol試劑盒操作說(shuō)明提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞總 RNA,室溫干燥RNA,加入20～40μL超純水溶解上述沉淀,雙光束紫外分光光度計(jì)測(cè)量總 RNA的 A260、A260/A280,計(jì)算其濃度[RNA濃度(μ g/μ L)計(jì)算:A260×40×稀釋倍數(shù)/1000],并用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的提取質(zhì)量。②逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:反應(yīng)體系 20μL:20 mmol MgCl24μL,10 mmol dNTP 2μL,10 ×Buffer 2μL,RNA 酶抑制(40 U/μ L)0.5μL,Oligo(dt)隨機(jī)引物 1μL,AMV(5 U/μ L)1μL,模板 RNA XμL(X=1/RNA 濃度),DEPC 處理水補(bǔ)足總體積;反應(yīng)條件:42℃60 min,99℃5 min。③RT-PCR 反應(yīng):FOXP3上游 :5′-CAAGTTCCACAACATGCGACC-3′,下游 :5′-GGTGGCAGGATGGTTTCTGAA-3′144 bp;β2-MG 上游:5′-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3′,下游 5′-CATCT TCAAACCTCCATGAT-3′124 bp;RT-PCR反應(yīng)體系25μL :10 mmol dNTP 0.8μL,25 mmol MgCl22.5μL,10 ×Buffer 2.5μL,Taq 酶 0.3μL,SYBRGREE 熒光染料 0.3μL,10 μ mol的上 、下游引物各0.5μL,cDNA 1μL,滅菌用水補(bǔ)足總體積 ;反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min,95℃30 s,60℃30 s,72℃40 s 40個(gè)循環(huán),72℃再次延升8 min,55～95℃溶解曲線測(cè)定。取5μL RT-PCR產(chǎn)物,2%瓊脂糖電泳觀察電泳結(jié)果,以確定實(shí)時(shí)熒光定量機(jī)器上所跑出的峰是本研究所要測(cè)定的目的基因和內(nèi)參的峰。相對(duì)mRNA表達(dá)量的計(jì)算,每個(gè)標(biāo)本中FOXP3基因的相對(duì)mRNA表達(dá)水平可直接用樣品各自內(nèi)參基因β2-MG表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)化,即每個(gè)標(biāo)本中FOXP3基因的相對(duì)mRNA表達(dá)水平可以采用相對(duì)定量法2-△△Ct計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

1) MDS組CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例、FOXP3基因表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。見表1。

表1 2組CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例及FOXP3基因表達(dá)量比較()

表1 2組CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例及FOXP3基因表達(dá)量比較()

與正常對(duì)照組比較,*P＞0.05

組別 n CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例/%FOXP3基因表達(dá)量MDS組 22 8.91±2.58* 6.63±2.78*正常對(duì)照組 8 8.35±1.32 6.52±1.54

2) RA組、RAEB組CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例、FOXP3基因表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01);RCMD組CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例、FOXP3基因表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05);RCMD組、RAEB組CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例、FOXP3基因表達(dá)水平與RA組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P＜0.01);RA組、RCMD組 CD4+CD25+T reg細(xì)胞比例、FOXP3基因表達(dá)水平與RAEB組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01),見表2。

表2 各組CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例及FOXP3基因表達(dá)量的比較()

表2 各組CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例及FOXP3基因表達(dá)量的比較()

與正常對(duì)照組比較:#P＜0.01,△△P＞0.05與 RCMD組、RAEB組比較,△P＜0.01與 RA組、RCMD組比較,*P＜0.01

組別 n CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例/%FOXP3基因表達(dá)量RA 組 6 6.43±1.34△# 4.04±1.01△#RCMD 組 11 9.16±1.87△△ 7.42±2.08△△RAEB組 5 12.0±2.80*# 10.19±2.99*#正常對(duì)照組 8 8.35±1.32 6.52±1.54

3 討論

正常人外周血和胸腺中的CD4+T細(xì)胞有5%～10%持續(xù)高表達(dá)白細(xì)胞介素2(interleukin-2,IL-2)受體α鏈(CD25)而被稱為CD4+CD25+T細(xì)胞亞群。這類細(xì)胞是具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)作用的一種專職抑制細(xì)胞又被稱為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg細(xì)胞)。其主要功能是強(qiáng)大抑制能力,在慢性炎性反應(yīng)、自身免疫病、器官移植、腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用[4-5]。

FOXP3基因特異性表達(dá)于CD4+CD25+T reg細(xì)胞內(nèi),屬轉(zhuǎn)錄因子,參與調(diào)節(jié)目的基因的活化和表達(dá),與免疫功能密切相關(guān),對(duì)于CD4+CD25+T reg細(xì)胞的發(fā)育和功能非常重要,參與了免疫耐受的分子機(jī)制。目前許多實(shí)驗(yàn)證實(shí) FOXP3是 CD4+CD25+T reg細(xì)胞主要調(diào)控基因,高特異性表達(dá)于CD4+CD25+Treg細(xì)胞內(nèi)[6-8]。

近年來(lái),隨著對(duì)MDS研究的深入,WHO已將其歸入了髓系腫瘤。腫瘤的免疫逃逸導(dǎo)致了機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫無(wú)應(yīng)答或免疫反應(yīng)低下,在實(shí)體瘤中,如在部分血液學(xué)腫瘤(如白血病、淋巴瘤)中已經(jīng)得到了證實(shí)[2]。由于CD4+CD25+Treg細(xì)胞功能上的特性對(duì)腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化增殖及功能存在著抑制作用,使其在腫瘤免疫逃逸中起到了關(guān)鍵性的作用。CD4+CD25+T reg細(xì)胞能抑制 T細(xì)胞對(duì)自體抗原的免疫應(yīng)答,因而在維持對(duì)自身成分耐受的同時(shí)也會(huì)阻止機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答,從而導(dǎo)致了腫瘤的免疫逃逸,隨著疾病的進(jìn)展,CD4+CD25+T reg細(xì)胞逐漸升高,導(dǎo)致腫瘤免疫地逐步降低,使得腫瘤細(xì)胞大量的生長(zhǎng),導(dǎo)致了機(jī)體的病癥更加嚴(yán)重,這可能是MDS逐步向白血病轉(zhuǎn)化的重要因素。

本研究結(jié)果顯示,RA、RCMD、RAEB組的CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例、FOXP3基因水平隨著疾病進(jìn)展逐漸增高;RA組CD4+CD25+T reg細(xì)胞比例、FOXP3基因水平均顯著低于RCMD組、RAEB組(均 P＜0.01),RAEB組CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例、FOXP3基因水平均顯著高于 RA組、RCMD組(均P＜0.01)。綜合上述結(jié)果可得出CD4+CD25+T reg細(xì)胞及FOXP3基因與MDS疾病進(jìn)展密切相關(guān)。CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例、FOXP3基因水平的逐漸升高,導(dǎo)致腫瘤免疫的逐步降低,可能是MDS病程逐步嚴(yán)重的重要因素。

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