張麗影，于國萍,*，于純淼

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

丹參紅色素的亞臨界水萃取工藝

張麗影1，于國萍1,*，于純淼2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

利用亞臨界水萃取丹參藥材中的丹參紅色素。以丹參酮Ⅱ-A的提取率作為丹參紅色素提取率的考察指標，通過單因素試驗研究在丹參紅色素的亞臨界水萃取過程中萃取溫度、萃取時間、物料粒徑、液固比、提取劑乙醇體積分數(shù)因素對丹參紅色素提取率的影響。在單因素試驗結果的基礎上，選擇萃取溫度、萃取時間、物料粒徑、液固比4個因素進行正交試驗，確定丹參紅色素的最佳亞臨界水萃取工藝。結果表明：4個因素對丹參紅色素提取率影響的主次順序為溫度>物料粒徑>料液比>時間；最優(yōu)組合為A3B1C1D3，即萃取溫度200℃、物料粒徑40～60目、液固比25:1(mL/g)、萃取時間10min。在此最優(yōu)組合基礎之上，選擇體積分數(shù)15%乙醇溶液作為萃取溶進行萃取，此時所得色素提取率最高為0.319%。

丹參；亞臨界水；丹參酮Ⅱ-A；丹參紅色素；提取率

Abstract：Red pigment was extracted fromSalvia miltiorrhizausing subcritical water. The major factors including extraction temperature, extraction time, particle size, liquid-material ratio and ethanol concentration played an important role in subcritical water extraction processing. The effects of above factors on extraction rate of red pigment were investigated. Moreover, the optimal extraction conditions of red pigment were explored by orthogonal experiments to be extraction temperature of 200 ℃,particle size of 40－60 meshes, liquid-material ratio of 25:1, extraction time of 10 min and ethanol concentration of 15%. The extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhizawas 0.319% under the optimal extraction conditions.

Key words：Salvia miltiorrhiza；subcritical water；tanshinone II-A；red pigment；extraction rate

丹參系唇形科鼠尾草屬植物(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖，具有活血通經(jīng)、除煩清心[1-2]、改善冠脈循環(huán)、消炎抗菌等藥理作用，并且對癌細胞轉移和血行擴散有明顯促進作用。丹參藥用有效成分分為脂溶性和水溶性兩大部分[3-4]。目前從丹參中分離得到的脂溶性成分和水溶性成分據(jù)報道有34種之多[5]。脂溶性成分為二帖醌類化合物，為色素成分，稱為丹參紅色素，也稱為總丹參酮。該色素是一種天然食用色素，安全性高，具有一定的藥理作用，有利于人體健康。

常用的丹參紅色素提取方法有水煎煮法、有機溶劑浸提法、超臨界CO2提取法等。這些方法或是提取時間長、有機溶劑使用量大，或是對有效成分的選擇能力較差。亞臨界水(subcritical water，SBW)是指壓力和(或)溫度在其臨界值(T=374℃，P=21.8MPa)之下的附近區(qū)域的液態(tài)水[6-7]。亞臨界水萃取技術(subcritical water extraction，SWBE)是指以水為提取劑，通過改變萃取溫度，改變水的極性，從而可以選擇性的萃取樣品中的無機或有機、極性或非極性的有機化合物[8]。SWBE是一種近十幾年發(fā)展起來的較新的不使用或少使用有機溶劑的綠色萃取技術[9]，具有設備簡單、易于操作、快速、得率高等優(yōu)點，其在中藥的生產(chǎn)、應用和分析領域有著很好的發(fā)展前景。因此，本實驗進行丹參紅色素的亞臨界水萃取技術的研究，為中藥有效成分的提取提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丹參根莖 寶豐醫(yī)藥有限公司；丹參酮Ⅱ-A標準品 中國藥品生物檢定所；蒸餾水、無水乙醇、乙酸乙酯(均為分析純)。

1.2 儀器與設備

FW-100型萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；RE-52型旋轉蒸發(fā)儀 上海博通儀器設備有限公司；SHZ-3循環(huán)水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；KCFD05-03型亞臨界反應釜 煙臺高新區(qū)科立自控設備研究所；AL-104型精密電子天平 上海梅特勒-托利多儀器設備有限公司；FDU-1100型冷凍干燥機 東京RIKAKIKAI公司；KQ-500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UVmini-1240紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

使用萬能粉碎機將干燥的丹參根莖粉碎、過篩，得到不同物料粒徑的丹參粉末，備用。

1.3.2 亞臨界水萃取丹參紅色素的影響因素

考察萃取溫度、萃取時間、物料粒徑、料液比和提取劑乙醇體積分數(shù)5個因素[10-11]對丹參紅色素提取率的影響。稱取一定物料粒徑的丹參粉末適量，用不同液固比的亞臨界水在一定溫度下萃取一定時間進行單因素試驗。確定單因素水平后，在單因素試驗的基礎上選擇萃取溫度、萃取時間、物料粒徑、料液比進行正交試驗，確定丹參紅色素的最佳亞臨界水萃取工藝條件。其中萃取溫度為120、140、160、180、200℃；萃取時間為5、10、15、20、25min；物料粒徑為≤40、40～60、60～80、80～100、≥100目；液固比為10:1、15:1、20:1、25:1(mL/g)；乙醇體積分數(shù)為0、5%、10%、15%、20%。

1.3.3 丹參紅色素提取率的測定方法

丹參紅色素也稱總丹參酮，以其中的主要成分丹參酮Ⅱ-A作為丹參紅色素的考察指標，進行色素提取率的計算。對亞臨界水萃取液冷卻抽濾，乙酸乙酯萃取分離，萃取后的脂相使用紫外-可見分光光度計在丹參酮Ⅱ-A最大吸收波長處測定OD值，計算色素提取率[12]。

1.3.4 丹參酮Ⅱ-A提取量的測定方法

精密稱取干燥至恒質(zhì)量的丹參酮Ⅱ-A標準品2mg，置于10mL容量瓶中，加入適量乙酸乙酯溶液并定容至刻度，準確吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL標準品溶液分別置于10mL容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，得質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50μg/mL的溶液，備用。

2 結果與分析

2.1 丹參酮Ⅱ-A標準曲線

對標準液進行掃描得丹參酮Ⅱ-A的最大吸收波長為449.5nm。在449.5nm條件下測定OD值，以OD值與丹參酮Ⅱ-A溶液質(zhì)量濃度進行線形回歸，得標準曲線方程：Y=0.0108X－0.0104，r2=0.9998，式中：Y為OD值，X為丹參酮Ⅱ-A質(zhì)量濃度/(μg/mL)，線性關系良好。線性范圍為10～50μg/mL。依據(jù)此曲線得出樣品中丹參酮Ⅱ-A的質(zhì)量濃度，并計算提取率。

2.2 亞臨界水萃取丹參紅色素的研究

2.2.1 溫度對丹參紅色素提取率的影響

圖1 溫度對丹參紅色素提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhiza

如圖1所示，丹參紅色素的提取率隨著萃取溫度的升高而增加，由120℃時的0.035%增加到180℃時的0.166%，提取率相對增加了4倍，且當溫度超過140℃時有顯著影響(P＜0.05)。這主要是因為萃取溫度是影響亞臨界水萃取技術的最主要因素，對萃取的速度、效率、選擇性都有很大的影響[13]。改變亞臨界水的萃取溫度，水的極性也隨之發(fā)生了改變，進而選擇性的萃取被提物中的極性或非極性的目標成分。升高溫度可以打破分子間的偶極引力、破壞被提物的中心結構，進而破壞被提物與目標成分間的相互作用力；同時升高溫度還可以降低流體黏度，使流體更易滲入被提物中，提高提取率。當溫度超過180℃后，藥材嚴重碳化，有明顯的焦糊味，萃取液顏色由棕紅色變?yōu)楹诤稚?，?/p>

素提取率雖有所增加，但增加趨勢不明顯。這可能是因為當溫度超過180℃以后，反應釜內(nèi)壓強有所增加，提取率升高。但由于壓力對亞臨界水萃取效率影響不大，只要適當?shù)膲毫κ顾３忠簯B(tài)即可實現(xiàn)亞臨界水萃取[14-15]。本實驗的壓力可達2MPa，故不考慮壓力作為萃取因素對提取率的影響。提取率增加不明顯也可能是因為受丹參酮穩(wěn)定性的限制，溫度過高易分解[16]。因此選擇萃取溫度180℃。

2.2.2 萃取時間對丹參紅色素提取率的影響

圖2 萃取時間對丹參紅色素提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhiza

如圖2所示，時間對色素提取率影響顯著(P＜0.05)。隨著萃取時間由5min增加到的15min時，提取率由0.090%增加到0.168%，提取率大約相對增加了88%；而當萃取時間由15min增加到25min時，提取率呈現(xiàn)了減小的趨勢。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是萃取時間在亞臨界水萃取中影響也較大。萃取時間的選擇在很大程度上取決于萃取溫度以及目標成分與被提物基質(zhì)間的天然性質(zhì)。亞臨界水的萃取時間隨溫度的升高而減少，在適當?shù)臅r間內(nèi)即可萃取完全。當提取時間過長時，目標成分受熱穩(wěn)定性的限制，在亞臨界狀態(tài)下易分解，提取率下降。同時這種現(xiàn)象可能是與組分之間存在“溶解互助”效應[17]有關：藥材成分復雜，其中性質(zhì)相近的組分之間可互為提取劑。提取時間過長，由于其中某些組分的分解而失去相互提攜的優(yōu)勢。用盡量短的時間，更有利于整個萃取效率的提高。因此丹參紅色素的萃取時間選擇為15min。

2.2.3 物料粒徑對丹參紅色素提取率的影響

如圖3所示，物料粒徑對丹參紅色素提取率有顯著影響(P＜0.05)。當物料粒徑不超過60～80目時，隨著物料粒徑的減小，丹參紅色素的提取率呈現(xiàn)增大的趨勢，由起初的0.104%增加到了0.161%提取率大約相對增加了60%。這主要是由于在液固萃取過程中，丹參粒徑的減小，使其表面積增加，液固界面面積增加，有利于溶劑滲透到被提物中，使得目標成分被有效萃取，顯著提高了色素提取率[18]。但當物料粒徑超過60～80目時，提取率呈現(xiàn)了減小的趨勢。樣品顆粒過細，在較高的溫度下焦糊現(xiàn)象明顯，甚至出現(xiàn)了結塊現(xiàn)象，不利于目標成分的提取，而且在實驗中不易操作處理。故物料粒徑選擇為60～80目。

圖3 物料粒徑對丹參紅色素提取率的影響Fig.3 Effect of particle size on extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhiza

2.2.4 液固比對丹參紅色素提取率的影響

圖4 液固比對丹參紅色素提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-material ratio on extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhiza

如圖4所示，當液固比由10:1(mL/g)增加到20:1(mL/g)時，丹參紅色素提取率由0.107%增加到了0.168%，提取率相對增加了55.45%，液固比對色素提取率影響顯著(P＜0.05)；當液固比高于20:1(mL/g)時，色素提取率雖有所增加，但增加趨勢不明顯，影響不顯著。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是亞臨界水萃取是在一定的溫度和壓力下進行的，萃取罐中水溶液體積的大小不僅會影響到罐中萃取壓力的大小，也同時會影響樣品在萃取液中的分散程度。隨著液固比增加，更多的萃取溶劑滲透到物料中，目標成分與溶劑接觸面積增大，使得目標成分更有效地被萃取，進而提高對目標成分的提取率。同時本實驗是在固定質(zhì)量的條件下，通過改變液體體積改變液固比。隨著液體體積增加，反應釜內(nèi)壓力增加，提取率也隨之增加。但當液固比超過20:1(mL/g)后，提取率增加趨勢不明顯。因此根據(jù)試驗條件選擇液固比為20:1(mL/g)，即選擇溶劑-蒸餾水的體積與物料丹參粉末的質(zhì)量的比為20:1(mL/g)進行試驗。

2.2.5 提取劑乙醇體積分數(shù)[10,19]對丹參紅色素提取率的影響

圖5 乙醇體積分數(shù)對丹參紅色素提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhiza

如圖5所示，當向萃取溶劑中加入0～20%乙醇時，乙醇體積分數(shù)對丹參紅色素的提取率影響顯著(P＜0.05)。未加乙醇時，丹參紅色素的提取率為0.193%；隨著萃取溶劑中乙醇體積分數(shù)增加到20%時，色素提取率增加到了0.334%，與未添加乙醇相比，提取率約增加了74%。這主要是因為當向水中加入提取劑以后，大大加強了被分離組分在亞臨界水中的溶解度，使該溶質(zhì)的分離因子大大提高，增加溶質(zhì)溶解度對溫度的敏感程度。因此加入提取劑的亞臨界水對植物原料中天然存在的目標成分的溶解能力增加，目標成分的提取率明顯增加。與傳統(tǒng)的有機溶劑浸提相比，有機溶劑的消耗大大降低了。

2.2.6 丹參紅色素提取條件的優(yōu)化

表1 L9(34)試驗方案及試驗結果Table 1 Design and results of orthogonal experiments

在以上單因素試驗的基礎上，不添加乙醇，以萃取溫度、萃取時間、物料粒徑、液固比為因素，設計四因素三水平正交試驗，以確定最佳的亞臨界水萃取工藝。試驗方案及結果見表1。

正交試驗極差分析結果表明，各因素對丹參紅色素的提取率影響的主次順序為溫度＞物料粒徑＞液固比＞時間。提取丹參紅色素的最佳工藝組合為A3B1C1D3，即溫度200℃、時間10min、物料粒徑40～60目、液固比25:1(mL/g)。驗證實驗結果表明：在此最佳條件下丹參紅色素的提取率為0.244%。

在上述正交試驗結果基礎上，稱取物料粒徑為40～60目的丹參粉末適量，按照25:1(mL/g)的液固比向萃取溶劑中加入15%的乙醇，在200℃條件下萃取10min。此條件下所得粗提色素提取率為0.319%，相對純水作為萃取溶劑，其提取率約增加了31%。

3 結 論

丹參紅色素的最優(yōu)亞臨界水萃取條件為萃取溫度200℃、液固比25:1(mL/g)、物料粒徑40～60目、提取劑乙醇體積分數(shù)15%、萃取時間10min，此條件下所得丹參紅色素提取率為0.319%。但是相對于丹參中丹參酮的含量，該色素提取率偏低，這可能是因為丹參紅色素是由多種丹參酮組成的，僅以丹參酮Ⅱ-A提取量作為色素提取率的考察指標過于單一，應考慮多種丹參酮提取量。同時影響亞臨界水萃取的因素主要包括萃取溫度、壓強、時間、料液比、物料粒徑以及提取劑種類和濃度等。本實驗僅是在萃取溫度、萃取時間、物料粒徑、固液比和乙醇體積分數(shù)5個因素條件下進行研究，其他影響亞臨界水萃取技術的因素以及所提色素的穩(wěn)定性和藥用價值還有待進一步研究。

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Optimal Extraction Processing of Red Pigment inSalvia miltiorrhizaby Subcritical Water

ZHANG Li-ying1，YU Guo-ping1,*，YU Chun-miao2
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

TS202.3

A

1002-6630(2010)22-0110-05

2010-06-28

黑龍江省中醫(yī)藥、中西醫(yī)結合重點科研項目(ZHY08-Z03)

張麗影(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品精深加工。E-mail：xiaoyingzi_2004@163.com

*通信作者：于國萍(1963—)，女，教授，博士，研究方向為食品化學。E-mail：yuguopingneau@hotmail.com