陳 艷，程 勝*，王曉麗，林松毅

(1.吉林工程技術(shù)師范學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林 長春 130052；2.吉林省水文水資源局，吉林 長春 130022；3.吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院營養(yǎng)與功能食品研究室，吉林 長春 130062)

正交多項(xiàng)式回歸設(shè)計(jì)優(yōu)化微波提取海藻糖工藝

陳 艷1，程 勝2,*，王曉麗3，林松毅3

(1.吉林工程技術(shù)師范學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林 長春 130052；2.吉林省水文水資源局，吉林 長春 130022；3.吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院營養(yǎng)與功能食品研究室，吉林 長春 130062)

為開發(fā)利用啤酒廢酵母資源，以啤酒廢酵母為實(shí)驗(yàn)材料、海藻糖為研究對象、蒸餾水為提取劑，利用單因素與正交多項(xiàng)式回歸設(shè)計(jì)相結(jié)合的試驗(yàn)方法，優(yōu)化微波提取海藻糖工藝。結(jié)果表明：獲得微波法提取海藻糖的回歸模型為Y=3.672+0.00142Z12－0.0297Z1+0.00187Z3[Z1為微波時(shí)間/min，Z2為液料比(mL/g)，Z3為微波功率/W]；優(yōu)化最佳工藝參數(shù)為液料比40:1(mL/g)、微波功率500W、微波時(shí)間25min、微波溫度80℃，在此參數(shù)條件下海藻糖得率達(dá)到5.07%；綜合分析發(fā)現(xiàn)：雖然微波提取法得率不及微波輔助法與超聲波輔助法，但提取時(shí)間顯著少于另外兩種方法(P＜0.05)，提取時(shí)間僅為微波輔助法的1/9、超聲波輔助法的1/15。

微波；啤酒廢酵母細(xì)胞；海藻糖；正交多項(xiàng)式；回歸模型

Abstract：In order to facilitate the development and utilization of waste beer yeast resource, trehalose was extracted from waste beer yeast by microwave extraction processing. The optimal extraction processing parameters were explored by single factor and orthogonal polynomial regression experiments. Results indicated that a regression model for trehalose extraction wasY=3.672+0.00142Z12－0.0297Z1+0.00187Z3 (where,Z1, microwave treatment time;Z2, liquid-solid ratio;Z3, microwave power). The optimal extraction conditions were liquid-solid ratio of 40:1, microwave power of 500 W, microwave treatment time of 25 min, and microwave treatment temperature of 80 ℃. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of trehalose could reach up to 5.07%. Compared with microwave-assisted and ultrasound-assisted methods, microwave treatment has less yield of trehalose; however, microwave extraction time was only 1/9 of microwave-assisted extraction method, and 1/15 of ultrasound-assisted extraction method.

Key words：microwave；waste beer yeast cell；trehalose；orthogonal polynomial；regression model

隱生生物之所以有這么頑強(qiáng)的生命力是和其體內(nèi)含有的一種重要物質(zhì)息息相關(guān)，即其體內(nèi)的海藻糖含量都很高[1]，例如沙漠中一種含有海藻糖的隱生生物為膜葉卷柏，睡蓮荷花或神圣蓮花的種子[2-3]，因此海藻糖又有“生命之糖”之美稱。最新的研究表明，外源性的海藻糖同樣具有對生物體和生物大分子良好的非特異性的保護(hù)作用，從而在食品、醫(yī)藥、生物化學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[4]。近年來，眾多科研學(xué)者對海藻糖的研究發(fā)現(xiàn)：啤酒廢棄酵母細(xì)胞中海藻糖含量十分豐富[5-7]，如唐傳核等[8]研究了乙醇法提取啤酒廢酵母細(xì)胞中海藻糖；周潔[9]采用超聲波法和三氯乙酸聯(lián)用提取啤酒廢酵母中的海藻糖；張宏梅等[10]采用微波法和乙醇法聯(lián)用提取啤酒廢酵母中的海藻糖。但是，不難發(fā)現(xiàn)有機(jī)溶劑作為提取劑的問題比較突出，不僅造成提取成本增加，而且將影響到后期分離純化技術(shù)。因此，本研究將以水作為提取劑，借助微波技術(shù)所具有的高穿透性、高選擇性及高效快速[11-13]等特點(diǎn)，采用單因素和多元正交多項(xiàng)式回歸設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法，擬構(gòu)建出微波法提取海藻糖的回歸模型與其優(yōu)化工藝條件，為后期開展高效、安全、穩(wěn)定的海藻糖產(chǎn)品提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒酵母細(xì)胞 市購；海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純級)Sigma公司；酒石酸、濃硫酸、蒽酮(均為分析純) 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

MAS-II微波萃取儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；J-6型多頭磁力加熱攪拌器 江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；CR20B2型高速冷凍離心機(jī) 日立公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市國立實(shí)驗(yàn)設(shè)備研究所；T6新悅-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 海藻糖含量檢測方法

在前期研究工作的基礎(chǔ)上[14-15]，利用蒽酮硫酸法測定海藻糖含量，啤酒酵母細(xì)胞中海藻糖含量與其得率計(jì)算按照式(1)和式(2)進(jìn)行。

1.3.2 微波液料比對海藻糖得率的影響

在微波功率700W、微波處理時(shí)間15min，微波處理溫度80℃的條件下，微波液料比依次為20:1、30:1、40:1、50:1、60:1(mL/g)，測定海藻糖得率，初步確定適宜的液料比范圍。

1.3.3 微波功率對海藻糖得率的影響

在液料比40:1(mL/g)、微波處理時(shí)間15min、微波處理溫度80℃條件下，微波功率依次為0、300、500、700、900W，測定海藻糖的得率，以初步確定適宜的微波功率。

1.3.4 微波溫度對海藻糖得率的影響

在液料比40:1(mL/g)、微波功率500W、微波處理時(shí)間15min條件下，微波溫度依次為30、40、60、80、90℃，測定海藻糖得率，以初步確定適宜的微波溫度。

1.3.5 微波時(shí)間對海藻糖得率的影響

在液料比40:1(mL/g)、微波功率500W、微波處理溫度80℃條件下，微波時(shí)間依次為5、15、25、35、45、55min，測定海藻糖得率，以初步確定適宜的微波處理時(shí)間。

1.3.6 三元正交多項(xiàng)式回歸設(shè)計(jì)方案

在單因素試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，借助三元正交多項(xiàng)式回歸設(shè)計(jì)方法[16]，重點(diǎn)考察微波時(shí)間、液料比以及微波功率3個(gè)因素對海藻糖得率的影響，進(jìn)一步優(yōu)化獲得微波法提取啤酒廢酵母中海藻糖的最佳工藝參數(shù)，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素編碼表如表1所示。

表1 三元正交多項(xiàng)式回歸設(shè)計(jì)因素編碼表Table 1 Factors, levels and codes of multiple orthogonal polynomial regression design

1.3.7 對比試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

在前期相關(guān)研究的基礎(chǔ)上[14-15]，以啤酒廢酵母細(xì)胞中的海藻糖得率和提取時(shí)間為衡量指標(biāo)，對比分析了3種處理方式對啤酒廢酵母細(xì)胞中海藻糖的提取效果影響，以確定最佳提取方法。

微波法[14]：精確稱取樣品(5±0.01)g，加水定容到200mL，放入微波萃取儀內(nèi)，在微波功率500W、微波溫度80℃的條件下，連續(xù)處理25min冷卻至室溫，離心取上清液測定海藻糖含量。

微波輔助法[15]：精確稱取樣品(5±0.01)g，加水定容到150mL，置于微波萃取儀內(nèi)，在微波功率600W，微波溫度80℃的條件下，微波處理3min，再高溫水浴3.5h，冷卻至室溫，離心取上清液測定海藻糖含量。

超聲波輔助法：精確稱取樣品(5±0.01)g，加水定容到200mL，放入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)內(nèi)，在超聲功率600W的條件下間歇處理20min時(shí)間，再高溫水浴6h，冷卻至室溫，離心取上清液測定海藻糖含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS V17.0在顯著性水平a=0.05下進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 液料比對海藻糖得率的影響

如圖1所示，隨著液料比的增加，海藻糖得率呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)液料比在20:1(mL/g)增加至40:1(mL/g)時(shí)，海藻糖得率顯著上升(P＜0.05)，當(dāng)液料比為40:1(mL/g)時(shí)海藻糖得率最大，繼續(xù)增加液料比，海藻糖得率顯著下降(P＜0.05)，說明只有當(dāng)酵母懸液與微波接觸的比表面積在合適的范圍內(nèi)時(shí)，海藻糖分子才可以高效快速地被釋放出來，因此選擇40:1(mL/g)為適宜的液料比。

圖1 液料比對海藻糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid-material ratio on the yield of trehalose

2.2 微波功率對海藻糖得率的影響

圖2 微波功率對海藻糖得率的影響Fig.2 Effect of microwave power on the yield of trehalose

如圖2所示，海藻糖得率在超聲功率0～500W有顯著上升趨勢(P＜0.05)，500W時(shí)海藻糖得率最大，繼續(xù)增加微波功率，海藻糖得率顯著下降(P＜0.05)。這可能是因?yàn)槲⒉ǖ臒嵝?yīng)使酵母細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)發(fā)生變性，可以在短時(shí)間內(nèi)破壞酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促使海藻糖迅速有效溶出，功率達(dá)到一定數(shù)值后，高功率的作用有可能破壞海藻糖結(jié)構(gòu)，使海藻糖含反而降低。在500W時(shí)，海藻糖得率出現(xiàn)峰值，且顯著高于其他組(P＜0.05)，因此，微波功率選擇500W為宜。

2.3 溫度對海藻糖得率的影響

圖3 微波溫度對海藻糖得率的影響Fig.3 Effect of microwave treatment temperature on the yield of trehalose

如圖3所示，隨著微波溫度的升高，海藻糖得率呈逐漸增加的趨勢，當(dāng)溫度在30～40℃變化時(shí)。海藻糖增加趨勢不顯著(P＞0.05)，繼續(xù)提高溫度，海藻糖得率顯著上升(P＜0.05)，溫度越高海藻糖得率越大，但是溫度過高需增加回流裝置增加設(shè)備與成本，綜合考慮，選擇80℃為宜。

2.4 微波時(shí)間對海藻糖得率的影響

圖4 微波時(shí)間對海藻糖得率的影響Fig.4 Effect of microwave treatment time on the yield of trehalose

如圖4所示，隨著微波時(shí)間的增加，海藻糖得率呈先升高后降低的趨勢。微波時(shí)間從5min增加至45min時(shí)，海藻糖得率顯著上升(P＜0.05)，繼續(xù)微波處理，海藻糖得率顯著下降(P＜0.05)，考慮到高功率長時(shí)間的微波處理會(huì)破壞海藻糖的結(jié)構(gòu)及酵母細(xì)胞內(nèi)其他有效成分，從而導(dǎo)致海藻糖得率與酵母營養(yǎng)價(jià)值的下降，因此選擇較短的微波時(shí)間25min為適宜的微波處理時(shí)間。

2.5 微波法提取海藻糖的數(shù)學(xué)模型建立

表2 多元正交多項(xiàng)式回歸設(shè)計(jì)試驗(yàn)分析結(jié)果Table 2 Results of orthogonal polynomial regression experiments

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以微波時(shí)間、微波功率、液料比為影響因子，以海藻糖得率為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行多元數(shù)據(jù)回歸分析，結(jié)果如表2所示。提取海藻糖的編碼空間回歸方程為Y=4.697+0.147X1+0.0473X2+0.0468X1X2。

2.5.1 微波法提取海藻糖回歸模型檢驗(yàn)

對多元正交多項(xiàng)式回歸方程(編碼空間)進(jìn)行回歸系數(shù)、回歸方程、失擬檢驗(yàn)。

2.5.1.1 回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

各因素和交互作用的統(tǒng)計(jì)量Fj以及顯著性水平結(jié)果如表2所示：微波時(shí)間對海藻糖得率影響顯著(P＜0.05)、微波功率對海藻糖得率影響較顯著(P＜0.1)，且本正交回歸試驗(yàn)范圍內(nèi)各因素對海藻糖得率的影響大小順序是：微波時(shí)間、微波功率、液料比。

2.5.1.2 回歸方程顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

回歸模型的方程顯著性檢驗(yàn)分析結(jié)果如下，根據(jù)回歸偏差平方和S回=0.381；剩余偏差平方和SR=0.818，計(jì)算可知F回=2.172＞F0.25(3,14)=1.52。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，方程的顯著性水平為0.25。

2.5.1.3 失擬檢驗(yàn)結(jié)果

為了估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差，進(jìn)行失擬檢驗(yàn)，根據(jù)Se=0.0142通過計(jì)算得知：Flf=45.537＞1。表明已求得的回歸方程是失擬的，這說明失擬平方和Slf中除含有實(shí)驗(yàn)誤差外，還含有其他條件因素及其交互作用的影響，可能還有更高次關(guān)系。這就需要進(jìn)一步查明原因，再做研究處理。

2.5.1.4 編碼空間回歸方程轉(zhuǎn)變?yōu)樽匀豢臻g的回歸方程

將因素編碼公式代入方程(1)，得欲求回歸方程為：

式中：自變量Z1：微波時(shí)間/min；自變量Z2：液料比(mL/g)；自變量Z3：微波功率/W。

2.5.2 最優(yōu)工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在數(shù)據(jù)處理平臺上，建立非線性規(guī)劃模型的要點(diǎn)，輸入非線性回歸方程及約束條件，對回歸方程進(jìn)行偏求導(dǎo)解，通過因子編碼表進(jìn)行計(jì)算得出最佳參數(shù)組合為正交組合設(shè)計(jì)中的14組試驗(yàn)，即微波時(shí)間25min、微波功率500W、微波溫度80℃，在此最佳工藝參數(shù)下，海藻糖的得率達(dá)到5.07%。結(jié)果表明：此最優(yōu)工藝可作為微波法提取啤酒酵母中海藻糖技術(shù)參考，對啤酒酵母的綜合利用具有重要的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

2.6 3種提取方法對海藻糖溶出量的對比分析

對比分析微波法、微波輔助法、超聲波輔助法3種提取方法對啤酒廢酵母細(xì)胞中海藻糖的提取效果影響，結(jié)果如圖5所示。從海藻糖得率方面考慮，各種提取方法對其影響效果的順序依次為微波輔助法＞超聲波輔助法＞微波法，海藻糖的得率分別為9.24%、7.72%、5.07%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，可知樣品經(jīng)微波輔助處理后再利用水浸提一段時(shí)間，海藻糖得率顯著高于其他兩種方法(P＜0.05)，是超聲波輔助法的1.197倍，微波法的1.822倍；從提取時(shí)間方面考慮，各種方法的順序依次為微波法＜微波輔助法＜超聲波輔助法，海藻糖的提取時(shí)間分別為25、233、380min，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，微波法的提取時(shí)間顯著小于微波輔助法與超聲波輔助法(P＜0.05)，僅為微波輔助法的1/9，超聲波輔助法的1/15。

綜合分析可知：若不考慮提取時(shí)間，僅從海藻糖得率方面考慮，則可采取微波輔助法；但在實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)中，不僅需要得率高，提取時(shí)間也要短，因此選用微波法對啤酒廢酵母海藻糖進(jìn)行提取，且該方法還具有成本低廉、預(yù)處理省時(shí)、雜質(zhì)溶出少，而且后續(xù)純化工藝簡單等優(yōu)點(diǎn)。

圖5 3種處理方式的對比分析結(jié)果Fig.5 Comparison on results of three extraction methods

3 結(jié) 論

3.2 綜合對比微波法、微波輔助法、超聲波輔助法3種提取方法可知：雖然微波提取法得率不及微波輔助法與超聲波輔助法，但提取時(shí)間顯著少于其他兩種方法(P＜0.05)，僅為微波輔助法的1/9，超聲波輔助法的1/15。因此，微波法更適合于啤酒廢酵母中海藻糖等功能性糖的提取，且在較短的時(shí)間內(nèi)獲得較高的海藻糖得率，與傳統(tǒng)的細(xì)胞破壁提取海藻糖的方法相比，微波提取具有很大的優(yōu)越性，主要表現(xiàn)在不需有機(jī)溶劑、提取時(shí)間短、海藻糖收率高、雜質(zhì)溶出少等特點(diǎn)。

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Optimization of Microwave Extraction Processing for Trehalose by Orthogonal Polynomial Regression Design

CHEN Yan1，CHENG Sheng2,*，WANG Xiao-li3，LIN Song-yi3
(1. College of Food Engineering, Jilin Tercher’s Institute of Engineering and Technology, Changchun 130052, China；2. Bureau of Hydrology and Water Conservancy of Jilin Province, Changchun 130022, China；
3. Laboratory of Nutrition and Functional Food, College of Quartermaster Technology, Jilin University, Changchun 130062, China)

TS201

A

1002-6630(2010)22-0119-05

2010-06-19

吉林省教育廳“十一五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2009474)

陳艷(1972—)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称贩治雠c檢測。E-mail：chenyanminy@163.com

*通信作者：程勝(1971—)，男，高級工程師，博士，研究方向?yàn)榉律夹g(shù)。E-mail：hemu2003@163.com