陳 合，余建軍，舒國偉，李世玉，王利紅，王雅鳳

（陜西科技大學(xué)生命與工程學(xué)院，陜西西安710021）

復(fù)合酶降解高溫蒸煮玉米秸稈的飼料化研究

陳 合，余建軍*，舒國偉，李世玉，王利紅，王雅鳳

（陜西科技大學(xué)生命與工程學(xué)院，陜西西安710021）

利用復(fù)合酶在其最優(yōu)條件下降解高溫蒸煮玉米秸稈，然后接入混合酵母同步發(fā)酵產(chǎn)菌體蛋白。確定了復(fù)合酶降解的最優(yōu)條件：4g底物（蒸煮秸稈3.072g）加入30mL pH4.8檸檬酸緩沖液，調(diào)pH4.8，121℃滅菌20min，待冷卻，無菌操作下加入25mg纖維素酶、10mg木聚糖酶、6mg β-葡聚糖酶、1.3mg果膠酶，在50℃、100r/min條件下酶解16h，產(chǎn)糖量0.9349g/30mL。混合酵母發(fā)酵實驗結(jié)果表明，玉米秸稈粗蛋白含量為27.125%，是原秸稈蛋白含量的4.13倍，效果顯著，酶用量低，發(fā)酵周期短。

復(fù)合酶，高溫蒸煮，玉米秸稈，混合酵母，飼料

玉米秸稈細胞壁結(jié)構(gòu)致密，木質(zhì)素作為外衣保護著纖維素和半纖維素免受酶的降解［1］。因此要用酶法進行有效降解，需對秸稈預(yù)處理［2］。本課題組對玉米秸稈進行高溫蒸煮預(yù)處理研究時，效果非常好，以降解率為目標(biāo)研究復(fù)合酶降解條件時，降解率達70.03%。國內(nèi)外很多研究人員對秸稈進行了同步發(fā)酵研究［3-5］，通過微生物發(fā)酵解除了降解所得糖對酶的抑制。但酶活最佳溫度一般在37～60℃之間，因此同步發(fā)酵時間會比較長［6］，且微生物長時間為維持自身新陳代謝會浪費大量碳源，或者需加大酶量彌補不足。本文研究目的為彌補同步發(fā)酵缺陷，先讓復(fù)合酶在其最優(yōu)條件下降解高溫蒸煮玉米秸稈一定時間，以便其降解出盡可能多還原糖，作為后續(xù)發(fā)酵的啟動碳源，然后再接入混合酵母進行同步發(fā)酵，縮短秸稈蛋白飼料化時間、節(jié)省酶用量、提高還原糖利用率。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

玉米秸稈 陜西省西安市未央?yún)^(qū)剛采收完玉米棒的新鮮青秸稈，待晾干，用小型高速粉碎機將原秸稈粉碎，過40目篩，經(jīng)180℃高溫蒸煮1.5h，60℃烘干至恒重（0.768g高溫蒸煮秸稈相當(dāng)于1g原秸稈）；產(chǎn)朊假絲酵母（利用六碳糖）、嗜單寧管囊酵母（利用戊糖） 均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），編號分別為1807、1771；纖維素酶10000U（經(jīng) QB2583-2003的 FPA測定方法，濾紙酶活3500U，以下纖維素酶活均表示其濾紙酶活）、木聚糖酶10000U、β-葡聚糖酶10000U、果膠酶30000U 均來自肇東國科北方酶制劑有限公司；酵母粉、蛋白胨生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；產(chǎn)朊假絲酵母活化培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖20、蛋白胨20、酵母粉10，250mL三角瓶配制100mL，121℃滅菌20min，斜面菌種試管接入一環(huán)，培養(yǎng)20h；嗜單寧管囊酵母與上同，葡萄糖換為木糖；其余藥品 均為分析純。

1.2 實驗方法

表1 各單因素條件表

基本酶解條件：稱取底物質(zhì)量1.5g（以原秸稈質(zhì)量計），加入30mL pH4.8檸檬酸緩沖液，調(diào)pH至4.8，121℃滅菌20min。然后加入纖維素酶20mg（濾紙酶活70U）、β-葡聚糖酶8mg（80U）、木聚糖酶8mg（80U）、果膠酶 2mg（60U），溫度 50℃，轉(zhuǎn)速100r/min，時間23h。固定其它基本條件，做單因素實驗，各單因素條件如表1所示。最后做正交實驗，得到最優(yōu)條件，并驗證。

經(jīng)最適條件降解秸稈一定時間后，接入4%產(chǎn)朊假絲酵母、6%嗜單寧管囊酵母及相應(yīng)無機鹽輔料，在30℃發(fā)酵51h，3500r/min離心15min，測上清液可溶性蛋白含量，烘干沉淀物并測粗蛋白含量。

1.3 測定方法

還原糖測定采用DNS法；粗蛋白測定采用微量凱氏定氮法；可溶性蛋白測定采用考馬斯G250法。

2 結(jié)果與分析

2.1 各種酶量對產(chǎn)糖量影響

由圖1（為便于將4種酶解效果曲線圖整合在一塊，特用相應(yīng)酶活表示）可知，各種酶量達到一定量后，產(chǎn)糖量不再增加，因為糖濃度達到一定值，會對酶產(chǎn)生嚴(yán)重抑制作用。纖維素酶添加量對產(chǎn)糖影響比較大，一方面因為玉米秸稈含纖維素量高，另一方面纖維素難降解，加大酶劑量，作用顯著；木聚糖酶對產(chǎn)糖影響其次，雖然半纖維素易降解，但其含量很高，所以加大酶量效果明顯。另兩種酶對產(chǎn)糖量影響比較小，可能是纖維素酶本身含有大量內(nèi)外切葡聚糖酶及β-葡聚糖苷酶緣故，使得β-葡聚糖酶添加量影響輕微，而秸稈果膠含量很低，所以其對產(chǎn)糖量影響也比較低。確定各種酶加量為：纖維素酶20mg（70U）、β-葡聚糖酶8mg（80U）、木聚糖酶12mg（120U）、果膠酶2mg（60U）。

圖1 各種酶量與降解所得糖關(guān)系

2.2 底物添加量對產(chǎn)糖量影響

圖2 底物添加量與產(chǎn)糖量關(guān)系

由圖2可知，隨著底物添加量增大，底物對產(chǎn)糖量影響逐漸減小，特別是其添加量在1.5g以上時，影響明顯放緩，說明糖濃度對復(fù)合酶降解有明顯抑制作用。由于本實驗研究目標(biāo)是使混合酵母接入發(fā)酵前有盡可能高的產(chǎn)糖量，而混合酵母接入發(fā)酵后，隨著糖濃度降低，對復(fù)合酶抑制作用減小，即可達到邊糖化邊發(fā)酵目的，因此在這里，選擇底物添加量為3g。

2.3 時間對產(chǎn)糖量影響

由圖3可知，在酶解16h之后，時間對產(chǎn)糖量基本無影響，已處于近似水平曲線。說明糖濃度已達到幾乎完全抑制復(fù)合酶的酶活，故選擇酶解時間為16h。

圖3 時間與產(chǎn)糖量關(guān)系

2.4 搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)糖量影響

由圖4可知，復(fù)合酶降解高溫蒸煮秸稈需要一定搖床轉(zhuǎn)速，通過振蕩，以便復(fù)合酶更好地與相應(yīng)被降解物接觸，達到良好降解效果，故選擇搖床轉(zhuǎn)速100r/min即可。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速與產(chǎn)糖量關(guān)系

2.5 溫度對產(chǎn)糖量影響

由圖5可知，溫度對產(chǎn)糖量影響很大，在一定范圍內(nèi)，升高溫度可提高復(fù)合酶酶活，加快底物降解；然而溫度過高會降低酶的穩(wěn)定性，使其失活，從而影響酶水解的作用效果，故酶解溫度選擇50℃。

表2 正交實驗設(shè)計水平及正交結(jié)果

圖5 溫度與產(chǎn)糖量關(guān)系

2.6 pH對產(chǎn)糖量影響

由圖6可知，pH對產(chǎn)糖量影響也很大。復(fù)合酶對pH很敏感，因為pH過高或過低會改變酶解離狀態(tài)，影響酶與底物結(jié)合，故復(fù)合酶的pH條件確定為pH4.8。

圖6 pH與產(chǎn)糖量關(guān)系

2.7 復(fù)合酶降解高溫蒸煮玉米秸稈條件的優(yōu)化

影響復(fù)合酶降解高溫蒸煮玉米秸稈的主要因素是A（纖維素酶）、B（木聚糖酶）、C（β-葡聚糖酶）、D（果膠酶）、E（底物）、F（時間）、G（pH）、H（溫度），根據(jù)以上單因素實驗設(shè)計了以產(chǎn)糖量為指標(biāo)的L27（313）正交實驗，其中加入交互作用因素：A×B、A×C，搖床轉(zhuǎn)速定為100r/min。各條件的因素水平及正交結(jié)果，如表2所示。

對表2的原完整正交表進行方差分析，結(jié)果如表3所示。

由方差分析表3可知，對產(chǎn)糖量影響的因素大小為：H＞F＞E＞A＞A×B＞A×C＞B=D＞G ＞C。其中：A、E、F及H為高度顯著，應(yīng)選取較好水平為A3E3F3H2。其余均無顯著性，可忽略交互作用分析，從節(jié)省酶量及酵母發(fā)酵時pH需要高點的角度，選取為B1C1D1G2。

由于最優(yōu)條件不在正交實驗表中，故補做最優(yōu)條件三組平行實驗，結(jié)果穩(wěn)定，平均產(chǎn)糖量達到0.9349g/30mL，比以上實驗號效果都要好，故選擇最優(yōu)條件：A3B1C1D1E3F3G2H2，即復(fù)合酶降解高溫蒸煮玉米秸稈的最優(yōu)條件為：25mg纖維素酶、10mg木聚糖酶、6mg β-葡聚糖酶、1.3mg果膠酶、4g底物（蒸煮秸稈3.072g），16h、pH4.8、溫度50℃。

表3 方差分析表

復(fù)合酶在最優(yōu)條件下降解高溫蒸煮玉米秸稈16h后，進行同步發(fā)酵，搖床轉(zhuǎn)速仍為100r/min。結(jié)果，測得上清液的可溶性蛋白幾乎為零，沉淀物粗蛋白含量為27.125%，是原秸稈蛋白含量6.56%的4.13倍，且此時測得上清液中還原糖含量1%左右，說明還未發(fā)酵徹底，玉米秸稈飼料蛋白含量還有進一步提高的潛力，本課題組對此研究還在進行中。

3 結(jié)論

高溫蒸煮玉米秸稈的最優(yōu)復(fù)合酶降解條件為：4g底物（蒸煮秸稈3.072g）加入30mL pH4.8檸檬酸緩沖液，調(diào)pH4.8，121℃滅菌20min，待冷卻，無菌操作下加入25mg纖維素酶、10mg木聚糖酶、6mg β-葡聚糖酶、1.3mg果膠酶，在50℃、100r/min條件下酶解16h，產(chǎn)糖量0.9349g/30mL。經(jīng)初步混合酵母發(fā)酵實驗，玉米秸稈粗蛋白含量為27.125%，是原秸稈蛋白含量的4.13倍。實驗效果顯著，酶用量低，發(fā)酵周期短。

［1］Wyman CE，Yang B.Cellulosic biomass could help meet California′s transportation fuel needs［J］.California Agriculture，2009，63（4）：185-190.

［2］Su Donghai，Sun Junshe，Liu Ping，et al.Effects of Different Pretreatment Modes on the Enzymatic Digestibility of Corn Leaf and Corn Stalk［J］.Chinese J Chem Eng，2006，14（6）：796-801.

［3］Takagi M，Abe S，Suzuki S，et al.A method for production of alcohol directly from cellulose using cellulase and yeast［J］. Bicoconversion Symposium，1977：551-571.

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［5］羅靈芝，李春玲，袁敬偉，等.響應(yīng)面法優(yōu)化玉米秸稈同步酶解發(fā)酵產(chǎn)乙醇條件［J］.生物加工過程，2009，7（3）：27-33.

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Study on feed of steam-pretreated corn stover degraded by complex enzyme

CHEN He，YU Jian-jun*，SHU Guo-wei，LI Shi-yu，WANG Li-hong，WANG Ya-feng
（College of Life Science&Engineering，Shaanxi University of Science&Technology，Xi’an 710021，China）

Mixed yeast was inoculated for simultaneous saccharification and fermentation and for yielding of mycoprotein，later steam-pretreated corn stover was degraded by complex enzyme under the optimum conditions.The optimal conditions were：4g substrate（steam-pretreated corn stover 3.072g）was put in 30mL citrate buffer solution（pH4.8）and adjusted pH4.8 before pasteurization at 121℃for 20min.Then putting 25mg cellulase，10mg xylanase，6mg β-glucanase and 1.3mg pectase in it，under 50℃，the 100r/min condition enzymolysis 16h，the amount of producing the sugar was 0.9349g/30mL.The content of corn stover’s crude protein was 27.125%as a result of mixed yeast fermentation，and 4.13 times of original stover.The result was highly visible，low enzyme dosage and short fermentation period.

complex enzyme；steam pretreatment；corn stover；mixed yeast；feed

TS201.1

A

1002-0306（2010）12-0176-04

2009-11-24 *通訊聯(lián)系人

陳合（1956-），男，教授，研究方向：食品生物技術(shù)與工程。

陜西省科技攻關(guān)項目（2007JK01-13-2）；咸陽市科技攻關(guān)項目資助（K0311-2）。