姜艷喜，張建友，丁玉庭

（浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江杭州310014）

魷魚副產(chǎn)物自溶水解過程的生化變化及其機理

姜艷喜，張建友，丁玉庭*

（浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院，浙江杭州310014）

系統(tǒng)地研究了魷魚加工副產(chǎn)物內源性蛋白酶自溶水解過程中氨基氮、總可溶性氮（TSN）、TCA可溶性氮（TCA-N）、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）、pH、總酸、水解度（DH）以及游離脂肪酸的變化。確定最佳自溶水解條件為：料水比1∶1、溫度45℃、原始pH、水解時間39h。自溶水解39h離心后上清液中的氨基氮、TSN、TCA-N的含量分別為0.626±0.025、1.234±0.049、0.589±0.018g/100mL，TVB-N含量為 59.10±1.28mg/100mL，蛋白質水解度達到23.89%±0.13%。魷魚加工副產(chǎn)物內源性蛋白酶可以較好地水解其自身蛋白質，在39h的自溶水解過程中沒有腐敗現(xiàn)象發(fā)生。

魷魚加工副產(chǎn)物，自溶，pH，氨基氮，水解度

隨著魷釣規(guī)模的不斷壯大，我國的魷魚產(chǎn)量不斷增加。目前，我國魷釣船達到400多艘，年產(chǎn)量70多萬t，年捕撈產(chǎn)值60多億元，占世界魷魚捕獲量的17%左右，在國際魷釣業(yè)中占據(jù)著重要地位。魷魚加工過程中會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，主要由頭、內臟、皮、鰭和小導管組織組成，其中魷魚皮占8%～13%，肝臟占濕重的15%左右［1］，精巢組織約占7%左右［2］。以往這些副產(chǎn)物常做掩埋和丟棄處理，不僅污染環(huán)境而且浪費資源［3］。近年來有關如何有效利用魷魚加工副產(chǎn)物已經(jīng)成為新的研究熱點。本文系統(tǒng)研究了魷魚加工副產(chǎn)物內源性蛋白酶自溶水解工藝，測定其指標變化并闡述原因，探索魷魚副產(chǎn)物的加工新途徑。這對于魷魚副產(chǎn)物的綜合利用和高值化加工具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魷魚加工副產(chǎn)物 中國水產(chǎn)舟山海洋漁業(yè)公司提供，實驗室貯藏于-20℃冰柜中。

CR21GⅡ高速冷凍離心機 日本日立公司；752N紫外可見分光光度計、pHS-3C型pH計 上海精科實業(yè)有限公司；450Watt德國博朗多功能食品調理機 波蘭博朗有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；98-Ⅱ型強磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；THZ-82型水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇江南儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 自溶水解液的制備 魷魚副產(chǎn)物在冷凍狀態(tài)下經(jīng)切塊后置于打漿機中斬拌1min成漿，分別準確稱取50g漿液于250mL具塞三角瓶中，加入50g蒸餾水（水/原料，w/w），1.0mol/L的NaOH或HCl溶液調至所需的pH，于恒溫振蕩水浴鍋內自溶水解后沸水浴煮沸20min滅酶，流水冷卻，22000×g離心15min。離心后分層示意圖如圖 1，這與 Omid Tavakoli和 Hiroyuki Yoshida的研究結果相似［4］，分別取清液以及脂肪層進行測定分析。工藝流程如下：

魷魚副產(chǎn)物漿→加水混合→調pH→恒溫水浴自溶→滅酶（100℃下保持20min）→流水冷卻→離心（22000×g，15min）→離心清液、脂肪

表1 魷魚加工副產(chǎn)物的基本成分

圖1 水解液離心后示意圖

1.2.2 理化指標測定 水分采用直接干燥法（GB/T 5009.3-1985）；灰分采用高溫灼燒法（GB/T 5009.4-2003）；脂肪采用索式抽提法（GB/T 14772-2008）；含鹽量（以NaCl計）采用硝酸銀滴定法（GB/T 12457 -2008）；總糖采用苯酚-濃硫酸比色法［5］；pH測定采用酸度計；總酸含量的測定采用中和滴定法（GB/T 1245-90）；氨基氮含量的測定采用甲醛滴定法（GB 5009.39-85 1996）；揮發(fā)性鹽基氮采用半微量擴散法［6］；游離脂肪酸含量以及酸價的測定采用KOH標準滴定液滴定法［7］；總氮、粗蛋白、總可溶性氮采用凱氏定氮法［8］；TCA可溶性氮（TCA-N）含量的測定采用M.T.Morrissey等的方法［9］。

2 結果與討論

2.1 魷魚加工副產(chǎn)物的宏量成分組成

經(jīng)過測定，魷魚加工副產(chǎn)物中的宏量營養(yǎng)成分組成如表1所示。

從表1可以看出，魷魚加工副產(chǎn)物（頭、足、鰭以及內臟等）蛋白質含量較高，脂肪含量中等，是較好的蛋白質資源，可以作為蛋白資源進一步加工利用，提高其經(jīng)濟價值，避免資源浪費以及環(huán)境污染。它可以提供飼用的水解蛋白，也可以提供食用的食品風味添加劑，以此促進魷魚加工業(yè)的快速發(fā)展。

2.2 自溶水解條件的確定

以氨基氮含量、揮發(fā)性鹽基氮含量、水解度（DH）、可溶性氮得率以及TCA可溶性氮得率為相應指標，水解時間、溫度、初始pH和料水比為影響因素進行單因素實驗，確定最佳的自溶水解條件。

2.2.1 最佳料水比的確定 魷魚加工副產(chǎn)物利用內源性蛋白酶水解的反應必須在一定的水溶液中進行，這是因為蛋白酶必須溶解在相應的緩沖液中才能均勻分散在整個體系中，才能與底物接觸并對其發(fā)生作用。而且有時水也作為一種反應物參與酶解反應。此外，水解過程中產(chǎn)生的小分子物質也可在水溶液中迅速擴散，防止局部濃度過高而抑制水解反應的進行。

由圖2可以看出，隨著料水比的降低，水解度（DH）、蛋白質回收率、TCA可溶性氮（TCA-N）逐漸增加，分別由料水比2∶1時的15.37%±0.46%、25.95%± 1.04%、25.99% ±1.04%增加到料水比 1∶2時的31.40%±1.26%、42.25%±1.69%、40.25%±1.61%；而氨基氮隨著料水比的降低而降低，由料水比2∶1時的0.815±0.016g/100mL降低到料水比1∶2時的0.314±0.006g/100mL；說明底物濃度越小越有利于酶解進行。這是因為：a.反應是在水溶液中進行的，水在反應中有利于分子的擴散和運動。當?shù)孜餄舛冗^高時就使水的有效濃度降低，使反應速度下降；b.一定的底物是與酶分子中一定的活性部位結合的，并形成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物。過量的底物分子聚集在酶分子上就可能形成無活性的中間產(chǎn)物，這個中間產(chǎn)物是不可能分解為反應產(chǎn)物的。但是底物濃度并不是越低越好，底物濃度過低（即加水量過大）會使酶解液中氨基氮濃度過低，而且在以后的加工處理過程中還要進行濃縮、干燥，必然增加工藝的復雜性以及成本。

2.2.2 最佳自溶溫度的確定 溫度會影響酶和底物的結合、最大速率（Vmax）、酶和底物分子解離基團的解離常數(shù)（pK）、酶與抑制劑、激活劑或輔酶的結合等［10］。魷魚副產(chǎn)物內源性蛋白酶在35～65℃的自溶水解度與溫度的關系如圖3所示。

圖2 不同料水比對自溶水解的影響

圖3 不同的自溶水解溫度對水解度的影響

可以看出，35～45℃的溫度區(qū)間內，水解度呈現(xiàn)上升趨勢，由 19.34% ±0.39%升高到 23.31% ± 0.47%。而45～60℃呈現(xiàn)下降趨勢，由 23.31% ± 0.47%下降到16.05% ±0.32%；而60℃到65℃則下降不明顯。65℃時為15.21% ±0.30%，而原料初始的水解度就是14.98%±0.15%，表明此時的內源酶系基本失活。由此我們確定45℃為最佳的自溶水解溫度。

2.2.3 最佳自溶水解pH的選擇 pH對酶促反應的影響是多方面的，過酸或過堿都可使酶空間構象改變，使酶失活。根據(jù)過酸或過堿的程度不同，酶將遭受可逆或不可逆失活，并且pH可以改變底物分子及酶的解離狀態(tài)影響它們結合，從而降低酶活性［10］。

圖4 不同的初始pH對氨基氮濃度的影響

由圖4可以看出，離心清液中的氨基氮濃度隨著初始pH的不同而發(fā)生明顯的變化。在初始pH為6.0時氨基氮的濃度最高，而魷魚加工副產(chǎn)物的自身pH是6.02±0.2，所以便于控制和節(jié)約資源我們選擇自然的pH進行自溶水解，即無需添加酸堿來校準初始pH。

2.2.4 最佳自溶水解時間的確定 酶解時間同樣是影響水解反應的重要因素，過短則酶解反應不徹底，既造成資源浪費又達不到理想的效果，過長則由于內源混合酶系的活力逐漸降低、底物濃度減小以及產(chǎn)物的抑制，導致水解緩慢，此時就會浪費時間，所以應當控制適當?shù)拿附鈺r間。

圖5 不同自溶時間對水解效果的影響

由圖5可以看出，離心清液中的氨基氮濃度隨著水解時間的延長而呈現(xiàn)上升趨勢。在最初的12h內，由0.213±0.006g/100mL上升到0.578±0.017g/100mL，增加迅速；而在第12h到第39h的時間內增加緩慢，到第39h氨基氮濃度達到0.649±0.019g/100mL，較前12h增加速度明顯變緩。自溶水解時間延長至63h，氨基氮濃度為0.677±0.020g/100mL。綜合時耗、動力能源等因素，選擇39h最為最佳的自溶水解時間。

綜上所述，以氨基氮含量、水解度（DH）、揮發(fā)性鹽基氮含量、可溶性氮得率以及TCA可溶性氮得率為指標，通過單因素實驗確定最佳的自溶水解條件為：料水比1∶1、溫度45℃、原始pH（即原料本身的pH，勿調即可）、自溶水解時間39h。

2.3 自溶水解液pH和總酸含量的變化

在最適自溶條件下，水解液的pH和總酸含量的變化如圖6所示。

由圖6可以看出，魷魚廢棄物自溶水解過程中pH略有下降，由自溶水解初期的6.10±0.05到水解基本結束時的5.90±0.01。而在水解初期水解離心清液的pH下降速度較迅速，主要是因為氨基酸中羧基的解離度遠大于氨基的解離度，氨基酸的溶液會釋放出大量的質子；再則由于肌肉中大部分的有機酸類成分迅速溶出，導致水解液的pH降低。魚貝類肌肉的酸性組分包括乳酸、丙酸、丙酮酸、草酸、富馬酸、蘋果酸、檸檬酸等，由圖6可以看出，大部分肌肉的酸性組分在自溶水解的前6h即釋放出來，此時總酸含量為1.350±0.027g/100mL，而后上升趨勢變緩。這是由于自溶水解6h后，魷魚廢棄物的微觀組織結構已基本被破壞，自溶水解物由半固態(tài)變?yōu)榭梢宰杂闪鲃拥囊后w，隨著自溶時間的延長，總酸的含量增加緩慢，而這個階段增加的有機酸主要來自微生物生長產(chǎn)酸，經(jīng)過39h的自溶水解后，水解離心液中總酸含量達到1.581±0.032g/100mL。

圖6 魷魚廢棄物自溶水解液pH和總酸含量的變化

2.4 水解液中氨基氮、總可溶性氮以及TCA可溶性氮的變化

在最適自溶條件下的水解液的氨基氮、總可溶性氮以及TCA可溶性氮的變化如圖7所示。

圖7 魷魚廢棄物自溶水解液中氨基氮、總可溶性氮和TCA可溶性氮的含量的變化

水解前水解液有0.837±0.033g/100mL的可溶性氮溶于水，這主要包括肌漿蛋白氮，內源酶已經(jīng)酶解的氨基氮。水解前的6h內，水解液中水溶性蛋白質（即總可溶性氮）迅速增加，這是由于水不溶性的蛋白質在內源蛋白酶的作用下水解成為多肽和氨基酸而溶于水，隨后的時間內總可溶性氮的含量保持著小幅度的增長。與總可溶性氮不同的是，水解液中氨基酸含量（即氨基氮的含量）在0～9h都保持著相對較大幅度的增長，由0h的0.374±0.015g/100mL到9h的0.529±0.021g/100mL，9h后增長變緩，原因在于開始時內臟的多種蛋白酶酶活力較強，催化速率較快，生成的肽、氨基酸成分較多，隨著自溶水解的延長，蛋白酶活力逐漸減弱，催化速率逐漸降低。自溶水解基本結束時水解離心清液中的氨基氮的含量達到0.626±0.025g/100mL。

2.5 魷魚廢棄物自溶水解過程中水解度（DH）和TVB-N含量的變化

在最適自溶條件下的水解度（DH）和TVB-N含量的變化如圖8所示。

圖8 魷魚自溶水解過程中水解度的變化

圖8顯示了魷魚加工副產(chǎn)物自溶水解過程中DH隨時間的變化趨勢，可以看出，在最初的9h內水解度增加比較明顯，而后水解度增加變緩。當水解到39h時，水解度達到23.89%±0.13%，在最初的0h有水解產(chǎn)物是因為魷魚副產(chǎn)物產(chǎn)生的過程中，所處環(huán)境的影響因素使內源性蛋白酶也已發(fā)揮作用產(chǎn)生了游離氨基酸。水解度在開始增加較快是由于內源性的組織蛋白酶在開始時活力較高，催化蛋白水解的速率快，氨基酸的含量增加較快。隨著時間的延長，酶活力逐漸降低，以及底物濃度變小和產(chǎn)物的抑制作用，催化速率變小，導致DH增加緩慢。

魷魚副產(chǎn)物自溶開始時的TVB-N值為23.50± 1.20mg/100mL，在第 9h時達到 44.20±1.37mg/ 100mL，增加比較迅速；而后趨于平緩，30h時達到53.11±0.75mg/100mL；隨后呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，到第39h達到59.10±1.28mg/100mL。自溶水解過程中TVB-N含量增加的原因可能是由于蛋白質和氨基酸在其本身含有的脫羧酶、脫氨酶和細菌生長所產(chǎn)生的細菌性脫氨酶、脫羧酶共同作用下脫氨的結果［11］。

2.6 水解液中游離脂肪酸的變化

在最適自溶條件下的游離脂肪酸的變化和酸價的變化如圖9所示。

圖9 魷魚廢棄物自溶水解過程中游離脂肪酸和酸價的變化

游離脂肪酸和酸價的多少是衡量油脂好壞的重要指標之一。實驗結果表明，水解15h后，油脂的酸價達到 21.34±0.42mgKOH/g，39h達到 25.86± 0.51mgKOH/g。酸價在水解過程中不斷上升的主要原因是脂肪被內源性脂肪酶水解以及脂肪氧化的結果［12］。

3 結論

以氨基氮含量、DH、TVB-N含量、可溶性氮得率以及TCA可溶性氮得率為指標通過單因素實驗確定最佳的自溶水解條件為：料水比1∶1、溫度45℃、原始pH（即原料本身的pH，勿調即可）、自溶水解時間39h。研究魷魚廢棄物的自溶水解過程中的各種理化指標的變化并分析其變化原因，得出：魷魚加工副產(chǎn)物的自溶水解過程是利用自身的內源蛋白酶系，借助于適宜的反應條件將自身的蛋白質分解為氨基酸、多肽的過程。其中氨基氮、總可溶性氮以及TCA可溶性氮的含量隨著水解時間的延長而增加；伴隨的還有揮發(fā)性鹽基氮此類影響風味的物質，它是由自身的脫羧酶、脫氨酶和細菌滋生產(chǎn)生的細菌性脫氨酶、脫羧酶共同作用下將蛋白質和氨基酸脫氨產(chǎn)生的氨及胺類等堿性含氮物質脫除；同時內源性的脂肪酶以及脂肪本身的氧化作用也會導致自溶過程中的游離脂肪酸的含量增加。

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Biochemical changes in the squid processing wastes’auto-hydrolysate and mechanism analysis

JIANG Yan-xi，ZHANG Jian-you，DING Yu-ting*
（Zhejiang University of Technology，College of Biological and Environmental Engineering，Hangzhou 310014，China）

Biochemical changes in auto-hydrolysis of squid processing wastes were investigated.The optimum condition of auto-hydrolysis were as follow：material-water ratio 1∶1，temperature 45℃，the original pH，the time of auto-hydrolysis 39h.Results showed that amino nitrogen，TSN，TCA-N，TVB-N and the degree of hydrolysis was 0.626±0.025，1.234±0.049，0.589±0.018g/100mL，59.10±1.28mg/100mL，23.89% ±0.13%，respectively.ln a word，the endogenous protease in squid processing wastes can hydrolyze protein effectively and there was no putrefaction in the processing.

squid by-products；auto-hydrolysis；pH；amino nitrogen；the degree of hydrolysis

TS254.9

A

1002-0306（2010）12-0142-04

2009-12-16 *通訊聯(lián)系人

姜艷喜（1983-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術?；痦椖浚赫憬】萍紡d科研社會發(fā)展項目（2008C23021）。