于文會,戈 勝,姜曉文

(東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院,黑龍江哈爾濱150030)

機體在大手術、創(chuàng)傷、重癥感染等所致的嚴重應激狀態(tài)下,會發(fā)生內分泌代謝紊亂,出現(xiàn)腎上腺皮質激素的分泌增多,血糖、血壓升高,心率、呼吸加快等應激反應,并引起一系列代謝、營養(yǎng)、免疫等方面的變化,從而影響機體的正常生理功能及創(chuàng)傷愈合。創(chuàng)傷后過強的應激反應性損害,是近年研究的一個重要課題[1]。本研究結合傳統(tǒng)中獸醫(yī)理論,在傳統(tǒng)中藥方劑防腐生肌散的基礎上,以活血化瘀、祛腐生肌藥為主藥,清熱燥濕收膿藥為輔藥作為組方原則研制的中藥防腐生肌膏,應用于動物皮膚創(chuàng)傷模型后有良好的治療效果。本試驗通過考察該制劑對創(chuàng)傷應激小鼠的調節(jié)作用,從應激角度揭示其促進創(chuàng)面愈合的機理。

1 材料與方法

1.1 材料 TNF-α(批號：20090720)、IL-6(批號：20090726)及皮質醇放免試劑盒(批號：20090720)均購自北京華英生物技術研究所;γ放射免疫計數(shù)器(西安核儀器廠);防腐生肌膏由本教研室自制,其主要成分為血竭、乳香、紫草、三七、連翹、蒲公英、冰片、煅石膏、沒藥、大黃、黃柏、白芷、赤芍等。

1.2 試驗動物及分組 健康雄性KM小鼠90只,體重25 g±2 g,由漢方實驗動物養(yǎng)殖所提供。正式試驗前將小鼠在環(huán)境安靜的房間適應性飼養(yǎng)一周后按體重隨機分組,設正常對照組(normal control,NC)小鼠10只;創(chuàng)傷應激組(traumatic stress,TS)小鼠40只;創(chuàng)傷應激治療組(TS+treat)小鼠40只。

1.3 動物模型的建立 參照文獻[2]在創(chuàng)傷應激組和創(chuàng)傷應激治療組小鼠背部正中選擇一塊面積為2×3 cm2約占小鼠體表面積25%的完整皮膚,用8%硫化鈉脫毛,生理鹽水洗凈擦干,5%碘酊及75%酒精局部消毒后,用尖銳組織剪在脫毛處剪一直徑為1 cm圓形傷口,深達肌筋膜,破壞部分肌肉表面筋膜。

1.4 給藥方法 造模成功后創(chuàng)傷應激治療組小鼠皮膚創(chuàng)口涂抹防腐生肌膏,每天2次,厚約1 mm;正常對照組和創(chuàng)傷應激組小鼠不作處理。

1.5 取材及血清指標測定 創(chuàng)傷應激組和創(chuàng)傷應激治療組小鼠分別于造模后1 d、2 d、3 d、4 d的上午9時眼眶靜脈采血約1 mL,每次10只小鼠,血于無菌EP管中4℃靜置 30 min,2 000 r/min離心15 min,分離血清,-70℃保存。正常對照組(10只小鼠)采用相同方法于上午9時采血,分離血清。用放射免疫分析法測定血清TNF-α、IL-6和皮質醇的含量。

1.6 統(tǒng)計學處理 試驗數(shù)據(jù)應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析,采用單因素方差分析處理數(shù)據(jù),組間均數(shù)比較用最小顯著差(Least Significant Difference,LSD)t檢驗,P＜0.05即認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 防腐生肌膏對創(chuàng)傷小鼠血清中TNF-α的影響傷后1 d治療組 TNF-α水平極顯著低于應激組(P＜0.01),TNF-α的分泌明顯受到抑制;應激組的TNF-α水平在第1天和第4天出現(xiàn)兩個峰值,呈現(xiàn)雙峰現(xiàn)象;治療組TNF-α水平在第2天達峰值后逐漸降低,第4天降至正常水平。

2.2 防腐生肌膏對創(chuàng)傷小鼠血清中IL-6的影響傷后1 d小鼠血中的IL-6水平有明顯升高,并呈逐漸下降趨勢,治療組在第4天已恢復至正常水平;傷后1 d治療組IL-6水平極顯著高于應激組(P＜0.01),其后數(shù)天,治療組逐漸恢復至正常水平,而應激組在實驗期間始終高于對照組。

2.3 防腐生肌膏對創(chuàng)傷小鼠血清中皮質醇(cortisol)的影響 傷后各組小鼠血中皮質醇水平都有極顯著的升高(P＜0.01),皮質醇變化呈現(xiàn)雙峰現(xiàn)象,在第1天和第3天達峰值,其后逐漸降低,治療組在第4天降至正常水平;應激組的皮質醇水平在試驗期間明顯高于治療組(P＜0.05)。

表1 防腐生肌膏對創(chuàng)傷小鼠血清中TNF-α的影響(ng/mL,n=10,±S)

表1 防腐生肌膏對創(chuàng)傷小鼠血清中TNF-α的影響(ng/mL,n=10,±S)

注：與治療組比較,*：P ＜0.05,**：P＜0.01;與對照組比較,△：P＜0.05,△△：P＜0.01,下表同

組別 1 d 2 d 3 d 4 d TS 1.35±0.12**△△ 0.92±0.08* 1.06±0.10△△ 1.26±0.10**△△TS+treat 0.91±0.09△ 1.14±0.13△△ 1.02±0.05△△ 0.85±0.11 NC 0.78±0.11

表2 防腐生肌膏對創(chuàng)傷小鼠血清中IL-6的影響(pg/mL,n=10,±S)

表2 防腐生肌膏對創(chuàng)傷小鼠血清中IL-6的影響(pg/mL,n=10,±S)

組別 1 d 2 d 3 d 4 d TS 99.75±6.95**△△ 87.90±5.67△△ 85.53±6.52**△△ 75.84±4.54*△TS+treat 133.84±8.66△△ 95.45±7.32△△ 68.76±6.38 64.53±3.93 NC 65.50±3.98

表3 防腐生肌膏對創(chuàng)傷小鼠血清中皮質醇的影響(ng/m L,n=10,±S)

表3 防腐生肌膏對創(chuàng)傷小鼠血清中皮質醇的影響(ng/m L,n=10,±S)

組別 1 d 2 d 3 d 4 d TS 40.89±4.53*△△ 32.45±3.67**△△ 42.21±3.69**△△ 25.94±2.40**△△TS+treat 34.70±2.43△△ 15.58±2.36△ 22.34±2.00△△ 11.94±1.54 NC 9.31±0.81

3 討論

TNF-α由巨噬細胞產生,能夠促進早期炎癥反應,提高早期炎癥水平;同時它能提高局部成纖維細胞數(shù)量,主要通過促進成纖維細胞的有絲分裂,誘導基質的合成與成熟而促進傷口愈合[3]。許多細胞如單核巨噬細胞、活化T細胞和B細胞、上皮細胞、內皮細胞、纖維母細胞、T淋巴細胞等能產生 IL-6。IL-6能誘導B細胞、肝細胞產生免疫球蛋白和急性期蛋白,本身對細胞無直接損害作用,能促進中性粒細胞的活化、聚集,是反映機體炎癥與組織損傷的嚴重程度的重要指標[4]。創(chuàng)傷早期IL-6在激活局部和全身性宿主防御機制中起關鍵作用,以限制組織的進一步損傷。創(chuàng)傷后巨噬細胞分泌大量的TNF-α、IL-6參與機體過度的炎癥反應。Pape H C等[5]對多位重創(chuàng)傷患者研究發(fā)現(xiàn)其IL-6水平顯著升高;Caatania[6]等對熱損傷及創(chuàng)傷的研究也表明應激后TNF-α、IL-6明顯增加。TNF-α分泌適量可發(fā)揮免疫調節(jié)、抗感染作用,但分泌過多可導致機體感染性休克和多臟器功能衰竭[6]。在試驗中,創(chuàng)傷后第1天治療組小鼠的 IL-6水平顯著高于應激組,而TNF-α水平顯著低于應激組,說明過高的IL-6水平抑制了TNF-α的分泌,而且致傷后 TNF-α、Cor的分泌呈雙峰現(xiàn)象,這與眾多學者報告一致[7-9]。致傷2 d后,治療組小鼠 TNF-α、IL-6有不同程度的下降,與創(chuàng)傷應激組比較有顯著差異,說明防腐生肌膏具有下調炎性細胞因子的過度表達,減輕過度炎癥反應的作用。方劑中的大黃可抑制病理情況下TNFR1、TNFR2表達,降低血漿內 TNF-α水平,抑制TNF-α對腸黏膜上皮細胞的毒性作用[10]。白芷、紫草、蒲公英等有良好的抗炎抑菌作用腎上腺是應激反應的主要器官,創(chuàng)傷等刺激可使促腎上腺皮質激素(ACTH)及由腎上腺皮質分泌的皮質醇釋放增多,以后者更為明顯,因而臨床上將其作為判斷應激反應強度的主要指標[11]。許多神經(jīng)內分泌激素都有免疫調節(jié)作用,如生理應激狀態(tài)下增多的內源性鴉片樣多肽β-ET,就是抗體產生的強有力抑制劑,皮質激素也有免疫抑制作用,皮質激素的過度增加必然導致機體對各類細菌及毒素的易感性增強。適度的應激反應可提高機體對應激原的防御和適應能力,當嚴重創(chuàng)傷等應激原強烈持久作用時,機體將出現(xiàn)過度應激,HPA軸異?？哼M,可發(fā)生應激紊亂,造成對機體的繼發(fā)性損傷效應。防腐生肌膏在創(chuàng)傷應激后能抑制皮質醇的過度分泌,調節(jié)應激反應強度,這可能與方劑中所含的白芷、冰片、沒藥等止痛、鎮(zhèn)靜安神作用有關。

綜上所述,以活血化瘀、祛腐生肌為主組成的中藥方劑可通過雙向調節(jié)作用,改善機體的應激反應強度,避免過強應激對機體造成的傷害。

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