趙云峰，梁棟，張梅，吳學(xué)玲

支氣管哮喘（以下簡(jiǎn)稱哮喘）主要是在過敏原刺激下，Th2免疫反應(yīng)增強(qiáng)、Th1免疫反應(yīng)減弱所致的復(fù)雜病理過程，嗜酸性粒細(xì)胞、T 細(xì)胞及其細(xì)胞因子在哮喘整個(gè)病理過程中起著重要的作用。近年來研究顯示：細(xì)胞因子白細(xì)胞介素 27（IL-27）可以增強(qiáng) Th1免疫反應(yīng)、減弱 Th2免疫反應(yīng)[1]；抑制過度的炎癥反應(yīng)[2]。IL-27 在哮喘的病理過程中扮演著重要角色。本研究應(yīng)用卵白蛋白（OVA）建立哮喘小鼠模型，在OVA 致敏后的第 28～30 天，連續(xù) 3 d 每天滴鼻給予 IL-27，觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變、計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量，測(cè)定 BALF 中細(xì)胞因子 IL-4、IFN-γ 濃度，測(cè)定肺組織 T-bet mRNA表達(dá)量，旨在研究 IL-27 對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的影響及可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 卵白蛋白（ovalbumin，OVA，V 級(jí)）購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；氫氧化鋁粉購(gòu)自上海浦山化工公司；小鼠 IL-4、IFN-γ ELISA試劑盒購(gòu)自深圳晶美科技有限公司；小鼠 T-bet 及β-actin 檢測(cè)引物由上海博亞生物工程有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq 酶及緩沖液購(gòu)自美國(guó) Promega公司；重組IL-27 由日本 Hyogo 大學(xué) Yoshimoto教授惠贈(zèng)。光學(xué)顯微鏡由日本 Olympus公司制造；低溫冰箱由日本 Sanyo公司制造；離心機(jī)由美國(guó)Beckman公司制造。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和模型制備 選擇 5～6周齡，清潔級(jí)健康 BALB/c 雌性小鼠 24只，重量12～16 g，東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物房溫度波動(dòng)于20～24 ℃，濕度 70%，普通光照，自由飲水，喂食小鼠專用飼料。24只小鼠按隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為生理鹽水組、哮喘組及IL-27組，每組8只。①哮喘小鼠模型的建立：每只小鼠于第 1、14、21 天腹腔注射 0.1% OVA 0.1ml、100 g/L氫氧化鋁 0.2ml 進(jìn)行致敏，第 28～30 天連續(xù) 3 d用 3 g/L 戊巴比妥鈉 0.3ml 腹腔注射麻醉小鼠后，1% OVA 溶液 50 μl 滴鼻激發(fā)；②生理鹽水組小鼠：方法和步驟同上，采用生理鹽水代替 0.1%OVA；③IL-27組小鼠：在OVA 致敏的第 28～30 天，IL-27組小鼠分別給予 1 μg IL-27（溶于50 μl PBS 中）滴鼻[1]，其余處理同哮喘小鼠模型的建立，但 IL-27 滴鼻過程早于OVA 滴鼻激發(fā)過程10 min。

1.2 方法

1.2.1 計(jì)數(shù) BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量 最后1 次滴鼻激發(fā) 48 h 后對(duì)小鼠進(jìn)行相應(yīng)處置。每只小鼠給予 3 g/L 戊巴比妥鈉 0.3ml 腹腔注射麻醉小鼠，行氣管切開及氣管插管，縫線牢固結(jié)扎，用pH 值 7.4的PBS 液對(duì)右側(cè)支氣管肺泡進(jìn)行灌洗并收集 BALF，每次注入 1ml PBS 液，反復(fù)沖洗2 次后吸出，共 3 次，回收率 80% 以上。將收集的BALF 搖勻，離心半徑為5.8 cm，以 1000 r/min的速度離心 5 min，沉淀物涂片，HE 染色后在400倍放大倍數(shù)下，至少數(shù) 500個(gè)細(xì)胞，根據(jù)形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞，將 BALF 上清液留取 1ml 置于–70 ℃ 溫度保存，待測(cè) BALF 中 IL-4、IFN-γ濃度。

1.2.2 肺組織標(biāo)本處理 右側(cè)支氣管肺泡灌洗完畢后，無菌操作下切取左側(cè)部分肺組織，4% 多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片進(jìn)行 HE 染色。留取部分左側(cè)肺組織–70 ℃ 保存用于T-bet mRNA測(cè)定。

1.2.3 BALF 中細(xì)胞因子的測(cè)定 IL-4和IFN-γ采用 ELISA 測(cè)定，具體方法按照 ELISA 試劑盒內(nèi)說明書操作。

1.2.4 RT-CPR 測(cè)定肺組織中 T-bet mRNA 表達(dá) 提取肺組織總 RNA，引物序列為：正義鏈：5’2 TGC GGA GAC ATGCTG ACC 23’，反義鏈：5’2 TGA GCC CCA CTT GAA CCA 23’。RT 反應(yīng)體系20 μl，PCR 反應(yīng)體系 50 μl。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性 5 min，94 ℃ 變性 30 s，58 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸 1 min，循環(huán) 30 次，72 ℃ 終末延伸 10 min。各組樣品同時(shí)擴(kuò)增 β-actin 作為內(nèi)參照。PCR 產(chǎn)物行 1% 瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)掃描存盤。片段分子量大小經(jīng)核酸分子量 Marker 證實(shí)。采用 Quantity One 圖像分析系統(tǒng)分析并計(jì)算目的條帶與β-actin 條帶吸光度積分灰度值比值，以灰度值比值作為T-bet mRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)中各項(xiàng)指標(biāo)的所有數(shù)據(jù)均采用表示，各組間比較采用方差分析及q 檢驗(yàn)率的比較采用 χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析。以 P＜0.05 為對(duì)比組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 為對(duì)比組之間的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變

HE 染色可見生理鹽水組小鼠支氣管管腔光滑，上皮完整，氣道黏膜無水腫，肺泡間隔正常，氣道及血管周圍見少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。哮喘組小鼠氣道黏膜明顯水腫，黏膜基底層增厚，杯狀細(xì)胞增多，支氣管管腔縮小，部分可見黏液栓，氣道周圍血管擴(kuò)張充血，氣道黏膜層、黏膜下層、血管周圍組織、肺泡壁及肺泡腔內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以嗜酸性粒細(xì)胞為主，肺泡隔顯著增厚。IL-27組小鼠氣道黏膜無明顯水腫，管腔無縮小，氣道黏膜有少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，較哮喘模型組明顯為少，肺泡間隔未見異常。

2.2 3組小鼠 BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞的比較（見表1）

表1結(jié)果顯示：哮喘組小鼠 BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞占白細(xì)胞總數(shù)百分比均顯著高于生理鹽水組小鼠（P 均＜0.01）；而IL-27組小鼠 BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞占白細(xì)胞總數(shù)百分比均顯著低于哮喘組小鼠（P 均＜0.01）。

表1 3組小鼠 BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及嗜酸性粒細(xì)胞百分比的比較（ ，n=8）Table1 Comparison of eosinophil and the percentage of eosinophil with white blood cell in BALF among three groups( , n=8 )

表1 3組小鼠 BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及嗜酸性粒細(xì)胞百分比的比較（ ，n=8）Table1 Comparison of eosinophil and the percentage of eosinophil with white blood cell in BALF among three groups( , n=8 )

注：a與生理鹽水組比較，P＜0.01；b與哮喘組比較，P＜0.01Notes: aCompared with NS group, P＜0.01; bCompared with asthma group, P＜0.01.

組別Groups嗜酸性粒細(xì)胞（×107/L）Eosinophil (×107/L)嗜酸性粒細(xì)胞百分比（%）Percentage of eosinophil (%)生理鹽水組NS group 1.09±0.11 4.2±0.8哮喘組Asthma group 12.82±2.17a 18.6±2.7a IL-27組IL-27 group 2.21±0.33b 7.3±1.2b

2.3 3組小鼠 BALF 中 IL-4、IFN-γ 濃度的比較（見表2）

表2結(jié)果顯示：哮喘組小鼠 BALF 中 IL-4濃度明顯高于生理鹽水組，IFN-γ的濃度明顯低于生理鹽水組（P＜0.05）；而 IL-27組小鼠 BALF 中IL-4 濃度明顯低于哮喘組，IFN-γ 濃度明顯高于哮喘組（P＜0.05）。

表2 3組小鼠 BALF 中 IL-4、IFN-γ 濃度的比較（ ，n=8）Table2 Comparison of IL-4, IFN-γ concentration in BALF among three groups ( , n=8)

表2 3組小鼠 BALF 中 IL-4、IFN-γ 濃度的比較（ ，n=8）Table2 Comparison of IL-4, IFN-γ concentration in BALF among three groups ( , n=8)

注：a與生理鹽水組比較，P＜0.05；b與哮喘組比較，P＜0.05Notes: aCompared with NS group, P＜0.05; bCompared with asthma group, P＜0.05.

組別 Groups IL-4 (μg/L) IFN-γ (μg/L)生理鹽水組 NS group 25.6±2.7 36.5±5.2哮喘組 Asthma group 61.3±13.1a 11.1±3.3a IL-27組 IL-27 group 20.4±3.2b 50.3±6.3b

2.4 3組小鼠肺組織 T-bet mRNA 表達(dá)量的比較（見圖 1）

圖1結(jié)果顯示：哮喘組小鼠肺組織 T-bet mRNA 表達(dá)量（吸光度積分比值）（0.130±0.012）較生理鹽水組（0.342±0.038）明顯下降（P＜0.05），而 IL-27組小鼠肺組織 T-bet mRNA 表達(dá)量（0.268±0.048）明顯高于哮喘組小鼠（P＜0.05）。

圖1 3組小鼠肺組織 T-bet mRNA 表達(dá)量的比較Figure1 Comparison of T-bet mRNA expression in lung among three groups

2.5 相關(guān)性分析

哮喘組小鼠肺組織 T-bet mRNA 表達(dá)量與BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及IL-4 濃度均呈負(fù)相關(guān)（r 分別為–0.672、–0.732，P 均＜0.05）、與BALF 中 IFN-γ 濃度呈正相關(guān)（r=0.593，P＜0.05）；IL-27組小鼠肺組織 T-bet mRNA 表達(dá)量與BALF 中嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量及IL-4 濃度均呈負(fù)相關(guān)（r 分別為–0.564、–0.798，P 均＜0.05）、與BALF 中 IFN-γ 濃度呈正相關(guān)（r=0.739，P＜0.05）。

3 討論

IL-27是 2002年發(fā)現(xiàn)并命名的IL-6/IL-12細(xì)胞因子家族成員之一，由 EBI3（IL-12p40 相關(guān)蛋白）和p28（IL-12p35 相關(guān)多肽）兩個(gè)亞基構(gòu)成異源二聚體[2]。研究發(fā)現(xiàn) IL-27 主要由細(xì)菌激活的抗原遞呈細(xì)胞通過 CD40/CD40L的相互作用表達(dá)釋放[3]，它的表達(dá)與變應(yīng)原和炎癥刺激有關(guān)[4]。

T-bet是 Th1細(xì)胞分化過程中具有核心作用的轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn) IL-27 可以使 T-bet mRNA表達(dá)量增強(qiáng)，增強(qiáng) Th1細(xì)胞分化、抑制 Th2細(xì)胞分化。在野生型 CD4+T 細(xì)胞中 IL-27 可以誘導(dǎo)T-bet和IL-12 受體 β2亞單位（IL-12Rβ2）表達(dá)增殖[5]，一方面 IL-27 激活初始 CD4+T 過程中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子 1（STAT1）被磷酸化而激活[4]，激活的STAT1 誘導(dǎo)激活下游的T-bet，進(jìn)而誘導(dǎo) IL-12Rβ2表達(dá)，使初始 T 細(xì)胞獲得對(duì) IL-12的反應(yīng)性[6]，促進(jìn) Th1細(xì)胞分化；另一方面 IL-27通過上調(diào) ICAM-1 表達(dá)，然后與初始 CD4+T 表面LFA-1結(jié)合使 T-bet 表達(dá)顯著增強(qiáng)，促進(jìn) Th1細(xì)胞分化。IFN-γ是重要的Th1細(xì)胞因子，IFN-γ 可以反饋激活 T-bet，增強(qiáng) Th1免疫反應(yīng)，抑制 Th2免疫反應(yīng)，在沒有 IL-12和IFN-γ 存在時(shí)，IL-27激活 STAT1，通過 JAK1- STAT1 途徑促進(jìn) IFN-γ產(chǎn)生[1]。另外，IL-27 不僅抑制 Th2細(xì)胞分化，而且在免疫反應(yīng)中抑制 IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子分泌[1]，抑制 Th2免疫反應(yīng)。因此，IL-27 在抑制 Th2免疫反應(yīng)的同時(shí)促進(jìn) Th1免疫反應(yīng)的產(chǎn)生[7]。

本研究結(jié)果顯示：與生理鹽水組小鼠相比較，哮喘組小鼠肺組織炎癥反應(yīng)明顯加重、有較多嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；肺組織 T-bet mRNA 表達(dá)量明顯減少；BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及嗜酸性粒細(xì)胞占白細(xì)胞總數(shù)百分比明顯升高，而且 BALF 中 IL-4濃度明顯升高、IFN-γ 濃度明顯降低；說明哮喘組小鼠存在Th2免疫反應(yīng)亢進(jìn)、Th1免疫反應(yīng)減弱，哮喘組小鼠氣道、肺組織有明顯的炎癥反應(yīng)及T-bet mRNA 表達(dá)量的減少。

IL-27組小鼠與哮喘組小鼠比較，肺組織炎癥反應(yīng)明顯減輕；肺組織 T-bet mRNA 表達(dá)量明顯增高；BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及嗜酸性粒細(xì)胞占白細(xì)胞總數(shù)百分比明顯下降；BALF 中 IL-4 濃度明顯降低、IFN-γ 濃度明顯升高；另外，哮喘組、IL-27組小鼠肺組織 T-bet mRNA 表達(dá)量與BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及IL-4 濃度均呈負(fù)相關(guān)、與BALF 中 IFN-γ 濃度均呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明 IL-27 可能通過增強(qiáng)肺組織 T-bet mRNA表達(dá)量從而增強(qiáng) Th1免疫反應(yīng)、抑制 Th2免疫反應(yīng)，減少哮喘小鼠肺組織及BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而減輕哮喘小鼠肺組織炎癥反應(yīng)。

總之，IL-27能明顯減輕哮喘小鼠肺組織炎癥反應(yīng)、減少 BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量，可能與其增強(qiáng)哮喘小鼠肺組織 T-bet mRNA 表達(dá)、增強(qiáng)Th1免疫反應(yīng)、抑制 Th2免疫反應(yīng)有關(guān)，因此，IL-27 對(duì)哮喘的防治具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1]Yoshimoto T, Yoshimoto T, Yasuda K, et al.IL-27 suppresses Th2 cell development and Th2 cytokines production from polarized Th2 cells:a novel therapeutic way for Th2-mediated allergic inflammation.J Immunol, 2007, 179(7):4415-4423.

[2]Chae SC, Li CS, Kim KM, et al.Identification of polymorphisms in human interleukin-27 and their association with asthma in a Korean population.J Hum Genet, 2007, 52(4):355-361.

[3]Owaki T, Asakawa M, Kamiya S, et al.IL-27 suppresses CD28-mediated [correction of medicated]IL-2 production through suppressor of cytokine signaling 3.J Immunol, 2006, 176(5):2773-2780.

[4]Stumhofer JS, Hunter CA.Advances in understanding the anti-inflammatory properties of IL-27.Immunol Lett, 2008, 117(2):123-130.

[5]Huber M, Steinwald V, Guralnik A, et al.IL-27 inhibits the development of regulatory T cells via STAT3.Int Immunol, 2008,20(2):223-234.

[6]Yoshida H, Miyazaki Y.Interleukin 27 signaling pathways in regulation of immune and autoimmune responses.Int J Biochem Cell Biol, 2008, 40(11):2379-2383.

[7]El-behi M, Ciric B, Yu S, et al.Differential effect of IL-27 on developing versus committed Th17 Cells.J Immunol, 2009, 183(8):4957-4967.