李韶菁，任曉，董悅生，張華，鄭智慧，路新華，段海清

卡斯帕酶-3（Caspase-3）作為最重要的成員和關(guān)鍵的執(zhí)行分子，在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮著重要的功能。許多常見病與多發(fā)?。ú《拘愿腥纠绺忻?、關(guān)節(jié)炎等）、心腦血管疾病（例如腦卒中、心肌梗死等）、腫瘤、腦神經(jīng)退行性疾病（例如早老性癡呆癥、帕金森病等）的發(fā)生，都與卡斯帕酶-3的異常活動有關(guān)，因此，Caspase-3 被認(rèn)為是一個很有前景的藥物治療靶位點。高效、高選擇性的抑制劑將可能為治療上述與Caspase-3相關(guān)的疾病提供新的途徑[1-3]。

目前國外一些大公司已競相開展了此類藥物的研發(fā)工作，其中，美國 Aventis公司和Vertex公司共同開發(fā)的治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和膿血癥的卡斯帕酶的抑制劑 VX740（Pralnacasan）和VX799 已完成 II 期臨床研究；美國 Idun 制藥公司開發(fā)的卡斯帕酶的抑制劑（代號：IDN6556和IDN6734）主要用于治療急性心肌梗死，急性酒精中毒引起的肝衰竭；美國 Idun公司正在開發(fā)中的另一類卡斯帕酶的抑制劑 IDN5370 可預(yù)防缺血性腦卒中引起的腦神經(jīng)元的大量死亡及由此引起的偏癱和失語等后遺癥[1]。我們以 Caspase-3 為靶點，建立了一個 Caspase-3 抑制劑的高通量篩選模型，應(yīng)用此模型對微生物來源的共計 10026個次級代謝產(chǎn)物提取物進(jìn)行了篩選，其中一株真菌產(chǎn)生的化合物 F03ZA-575 對來源于人的Caspase-3 酶具有明顯的抑制活性，本文報道了該化合物的有關(guān)研究結(jié)果。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 試劑 人源 Caspase-3 酶儲液由華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)中心利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌 E.Coli 中表達(dá)并分離得到，–20 ℃ 凍存?zhèn)溆?；底?Ac-DEVD-AMC 購自美國 Sigma公司；其余化學(xué)試劑均為分析純或色譜純試劑。

1.1.2 主要儀器 Victor21420 多功能測定儀為美國 PE公司產(chǎn)品；低溫離心濃縮儀為德國 Christ公司產(chǎn)品；中壓層析分離制備系統(tǒng)為瑞士 BUCHI公司產(chǎn)品；HPLC 高壓液相分析和半制備系統(tǒng)為美國 Waters公司產(chǎn)品；500 MHz 核磁共振為美國Inova公司產(chǎn)品。

1.1.3 實驗菌種與提取物 放線菌株及真菌菌株由華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司天然藥物室微生物菌種庫提供；篩選用放線菌及真菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物樣品由微生物代謝產(chǎn)物庫提供。

1.2 方法

1.2.1 Caspase-3 酶活力測定方法的建立和優(yōu)化

1.2.1.2 Caspase-3 酶測活溶液的配制 Caspase-3酶測活緩沖液含 20 mmol/L HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸），0.1% CHAPS[3-3-（膽酰氨丙基）二甲氨基丙磺酸內(nèi)鹽]，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L DTT（二硫蘇糖醇），10% 蔗糖，1 mmol/L EDTA，pH 7.5。熒光底物 Ac-DEVD-AMC 儲液：稱取 2.5 mg Ac-DEVD-AMC 粉末，加 0.74ml DMSO 溶解，配制成 10 mmol/L的儲液。Ac-DEVD-AMC 工作液：準(zhǔn)確吸取所需量的Ac-DEVD-AMC 儲液，加測活緩沖液稀釋成濃度為1 μmol/L的工作溶液（用前臨時配制）。

1.2.1.3 Caspase-3 酶活力測定方法的建立和優(yōu)化 在96 孔板上分別固定一種底物的濃度，研究底物或 Caspase-3 濃度的變化與酶活性的關(guān)系。在最佳底物濃度條件下，觀察不同的反應(yīng)溫度與酶活性的關(guān)系，在此基礎(chǔ)上確定酶的加入量與酶反應(yīng)曲線的線性范圍。

1.2.2 微生物來源的Caspase-3 酶抑制的篩選 在96 孔板的樣品測定孔中，分別加入 2 μl的待測樣品、55 μl 酶工作液，對照孔和空白孔分別以 2 μl DMSO和55 μl 測活緩沖液代替酶液，其余與樣品孔相同。37 ℃ 保溫 15 min，各孔中加入濃度為1 μmol/L的底物工作液 45 μl。離心 2 min 并振搖混勻，測定各孔在以 355 nm 為激發(fā)波長，以460 nm 為發(fā)射波長下的熒光強度值（F1），37 ℃ 保溫 120 min 后，再測定各孔在同樣條件下的熒光強度值（F2）。

樣品對 Caspase-3 酶抑制率的計算公式為：

選取抑制率大于80%的樣品為陽性樣品。

1.2.3 陽性真菌 F03ZA-575 產(chǎn)生的對 Caspase-3酶具有抑制作用的活性物質(zhì)的分離

1.2.3.1 陽性菌株 F03ZA-575的來源 陽性菌株 F03ZA-575 為真菌，來源于華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)中心（微生物藥物國家工程研究中心）微生物菌種庫，采自我國云南省。

1.2.3.2 菌株 F03ZA-575的培養(yǎng) 將菌株F03ZA575 斜面接種于含種子培養(yǎng)基（含 2.0% 淀粉；0.2% 豆餅粉；0.6% 麥芽粉；0.3% 酵母粉；NaCl 0.2%；FeSO4·7H2O 0.1%；0.2% CaCO3，pH 7.0）的500ml 三角瓶中，27 ℃ 培養(yǎng) 3 d，按 10%的接種量接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基（大米 97.5%，黃豆餅粉 2.5%），27 ℃ 靜止培養(yǎng) 8 d。

1.2.3.3 菌株 F03ZA-575 發(fā)酵液的提取分離 F03ZA-575 固體發(fā)酵培養(yǎng)物 2000 g，加入4000ml的乙酸乙酯，萃取得到褐色 F03ZA-575粗提物 4.2 g，粗提物活性測定結(jié)果為IC50=18.7μg/ml。

1.2.3.4 活性組分的硅膠柱層析精制 取 4 g 粗提物，加少量甲醇溶解，使用硅膠柱（Φ3.6cm×40 cm）氯仿－甲醇梯度洗脫，收集洗脫液，40ml/管，共收集 120 管。合并目標(biāo)活性組分，濃縮抽干后得黃色固體 1.1 g。

1.2.3.5 活性組分的LH-20 柱分離純化 活性粗品用甲醇溶解后進(jìn)行 LH-20 柱分離純化，收集洗脫液，20ml/管收集洗脫液共收集 50 管。檢測各管的活性同時對照 HPLC 分析結(jié)果（色譜柱：Kromasil 10 μm，Φ250 mm×4.6 mm），合并目標(biāo)活性組分，濃縮抽干后得淺黃色固體 78 mg。

1.2.3.6 活性組分的結(jié)晶精制 取上述淺黃色固體 40 mg，溶于氯仿，然后向氯仿溶液中緩慢滴加甲醇使白色沉淀緩緩析出。離心，過濾并減壓蒸干，得到活性組分 F03ZA-575（白色固體）21 mg。

2 結(jié)果

2.1 Caspase-3 酶活力的影響因素

2.1.1 反應(yīng)體系中底物 Ac-DEVD-AMC 對酶活力的影響 保持反應(yīng)體系中其他組分濃度不變，改

圖1 底物濃度對卡斯帕酶-3 活性的影響Figure1 The effect of substrate concentration on Caspase-3 activity

變底物 Ac-DEVD-AMC的工作液濃度，觀察其對酶促反應(yīng)體系的影響，見圖 1。實驗結(jié)果表明，Caspase-3 酶的活力隨底物濃度的增加而增加，當(dāng)工作液的濃度在0.6 μmol/L 以上時，酶活力達(dá)到最大。因此，選擇底物工作液的濃度為1 μmol/L 已能滿足活性測定要求。

2.1.2 反應(yīng)體系溫度對酶活力的影響 在反應(yīng)體系中保持上述選定的各組分的濃度不變，觀察反應(yīng)體系溫度對酶促反應(yīng)體系的影響，見圖 2。結(jié)果表明，用該方法測定 Caspase-3 酶的活力，37 ℃ 時達(dá)到最大值，因此選擇 37 ℃ 為測活溫度。

圖2 反應(yīng)溫度對卡斯帕酶-3活性的影響Figure2 The effect of reaction temperature on Caspase-3 activity

2.1.3 Caspase-3 酶反應(yīng)曲線 在上述最佳底物濃度和最佳反應(yīng)溫度條件下，通過改變 Caspase-3酶的加入量測得的Caspase-3 酶活曲線見圖 3。由圖 3 可見，Caspase-3 酶液的加入量在0～2 μl 范圍內(nèi)呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) r=0.9946，據(jù)此選定反應(yīng)體系中 Caspase-3 酶的加入量為2 μl。

圖3 酶活性曲線Figure3 The enzyme activity curve

2.2 已知 Caspase-3 酶抑制劑陽性化合物對酶促反應(yīng)體系的驗證

用已知 Caspase-3 抑制劑陽性化合物 ACDEVD-CHO[6]對酶促反應(yīng)體系進(jìn)行了驗證，結(jié)果顯示其對篩選體系可以產(chǎn)生劑量依賴的抑制關(guān)系，確定了該篩選模型的可行性。

2.3 微生物來源的Caspase-3 酶抑制劑的篩選結(jié)果

利用上述 Caspase-3 酶抑制劑高通量篩選方法，對來源于放線菌、真菌的共 10026個發(fā)酵液提取物樣品進(jìn)行了篩選，初篩得到陽性樣品 47個（陽性率 0.6%），復(fù)篩得到陽性樣品 10個（陽性率 0.1%）。

2.4 化合物 F03ZA-575的結(jié)構(gòu)解析

化合物 F03ZA-575的1H-NMR和13C-NMR的測定數(shù)據(jù)及與Duclauxin 文獻(xiàn)報道數(shù)據(jù)的比較見表1，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖 4。

表1 F03ZA-575和Duclauxin的核磁共振（CDCl3）數(shù)據(jù)Table1 NMR data (CDCl3) of F03ZA-575 and Duclauxin

圖4 F03ZA-575的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure4 The chemical structure of F03ZA-575

2.5 化合物 F03ZA-575 對 Caspase-3 酶抑制活性的測定結(jié)果

化合物 F03ZA-575 對 Caspase-3 酶抑制活性的測定結(jié)果見圖 5，從該圖可以看出，化合物F03ZA-575 對 Caspase-3 酶呈現(xiàn)出劑量依賴的抑制作用，其 IC50值為12.5μg/ml。

3 討論

圖5 F03ZA-575 對 Caspase-3 酶的抑制活性曲線Figure5 The inhibitory activity curve of F03ZA-575 to Caspase-3

Caspase-3 作為Caspases 家族中最重要的成員之一，是哺乳動物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3 除與心腦血管疾病、腫瘤的發(fā)生有一定的關(guān)系外，在神經(jīng)退行性疾病的病理過程中也起著很重要的作用。Caspase-3 在這些疾病的病理過程中，不僅僅是起著凋亡的效應(yīng)器作用，還能直接與老年性癡呆癥、帕金森癥、亨廷頓舞蹈病、脊椎小腦失調(diào)等疾病的致病蛋白質(zhì)分子相互作用，參與這些疾病的致病機制[9-11]。因此，Caspase-3 也是治療神經(jīng)退行性疾病的一個新的重要的靶位點，尋找 Caspase-3 高效、高選擇性的抑制劑將為治療神經(jīng)退行性疾病提供新的途徑[2]。

利用 E.coli 表達(dá)的人 Caspase-3 酶，建立了一種基于96-孔板的Caspase-3 酶抑制劑的高通量篩選模型，通過反應(yīng)前后熒光強度的變化檢測樣品對 Caspase-3 酶的抑制活性。該方法具有快速準(zhǔn)確、靈敏度高的特點，特別適合于大量樣品的篩選。利用該篩選模型，通過對 10026個微生物發(fā)酵提取物中的篩選，從一株真菌產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了一個對 Caspase-3 酶有較強抑制活性的化合物，結(jié)構(gòu)解析確認(rèn)該化合物與Duclauxin的結(jié)構(gòu)相同。Duclauxin 最早是由 Shibata等[7-8,12]報道的具有抗癌活性的化合物，但對該化合物的抗癌機制未見有很詳細(xì)和深入的報道，本文首次報道了 Duclauxin 對來源于人的Caspase-3 酶的抑制活性，將對 Duclauxin 在抗腫瘤作用機制和與Caspase-3 酶有關(guān)的其他疾病治療方面的深入研究，提供有用的信息。

[1]Fang Q, Song B.Advances in the inhibitors of caspase 3.Foreign Med Sc (Section Pathophysiology Clin Med), 2001, 21(6):459-461.(in Chinese)方強, 宋波.Caspase 抑制劑研究進(jìn)展.國外醫(yī)學(xué)(生理、病理與臨床分冊), 2001, 21(6):459-461.

[2]Zhang YH, Li J, Zhou ZL.Caspase-3: a new target for neurodegenerative diseases treatment.Prog Biochem Biophy, 2003,30(2):175-179.(in Chinese)張亞輝, 李佳,周忠良.Caspase-3: 治療神經(jīng)退行性疾病的新靶點.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2003, 30(2):175-179.

[3]Liu XS, Jiang JK.Caspases and Apoptosis.Foreign Med Sci (Section Clini Biochem Lab Medi), 2000, 21(6):322-324.(in Chinese)劉小珊, 蔣紀(jì)凱.Caspases與細(xì)胞凋亡.國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)雜志, 2000, 21(6):322-324.

[4]Mittl PR, Di Marco S, Krebs JF, et al.Structure of recombinant human CPP32 in complex with the tetrapeptide acetyl-Asp-Val-Ala-Aspfluoromethyl ketone.J Biol Chem, 1997, 272(10):6539-6547.

[5]Zhang Y, Shen BH, Yu QW, et al.Fluorescent quantitative assay of Caspase-3 activity.J Cell Mol Immunol, 2001, 17(2):188-190.(in Chinese)張勇, 沈佰華, 余奇文,等.用熒光法定量檢測 Caspase-3的活性.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2001, 17(2): 188-190.

[6]Garcia-Calvo M, Peterson EP, Leiting B, et al.Inhibition of human caspases by peptide-based and macromolecular inhibitors.J Biol Chem, 1998, 273(49):32608-32613.

[7]Shibata S, Ogihara Y, Tokutake N, et al.Duclauxin, a metabolite of Penicillium duclauxi (Delacroix).Tetrahedron Letters, 1965, 18:1287-1288.

[8]Ogihara Y, Tanaka O, Shibata S.On the metabolites of penicillium duclauxi delacroix--3.The reactions of duclauxin with ammonia and primary amines.The structures of desacetylduclauxin, neoclauxin,xenoclauxin and cryptoclauxin.Tetrahedron Letters, 1966, 25:2867-2873.

[9]Zhang W.Human caspase family protease and apoptosis.Foreign Med Sci (Section of Genetics), 1999, 22(6):290-293.(in Chinese)張偉.人類caspase家族蛋白酶與凋亡.國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊, 1999,22(6):290-293.

[10]Zeng YY.Advance in molecular mechanism of cellular apoptosis.Bull Natl Nat Found China, 1999, 22(3):137-144.(in Chinese)曾耀英.細(xì)胞凋亡分子機制的研究進(jìn)展.中國科學(xué)基金, 1999,22(3):137-144.

[11]Concha NO, Abdel-Meguid SS.Controlling apoptosis by inhibition of caspases.Curr Med Chem, 2002, 9(60):713-726.

[12]Kuhr I, Fuska J, Sedmera P, et al.An antitumor antibiotic produced by Penicillium stipitatum Thom; its identity with duclauxin.J Antibiot(Tokyo), 1973, 26(9):535-536.