孫旭妍，陶敏芳，程蔚蔚，王玉東

自雌激素受體（ER）β亞型被克隆出來后，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2種ER亞型在成骨細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，經(jīng)脫氫表雄酮（DHEA）體外作用后，成骨細(xì)胞 ERα亞型的轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化，而 ERβ亞型的轉(zhuǎn)錄水平則明顯增高，且骨保護(hù)因子（OPG）與ERβ的轉(zhuǎn)錄水平呈線性正相關(guān)[1-2]。由于天然雌二醇（E2）與ERα和ERβ的活化蛋白-1（AP-1）位點(diǎn)結(jié)合后，可表現(xiàn)出不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：與ERα結(jié)合后激活轉(zhuǎn)錄，而與ERβ結(jié)合后則抑制轉(zhuǎn)錄[3]。因此，我們嘗試在體外利用小干擾RNA（siRNA）技術(shù)構(gòu)建 ERβ 沉寂表達(dá)載體，以明確 ERβ是否在防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中發(fā)揮主要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒 人成骨 hMG63 細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC），慢病毒載體系統(tǒng)購(gòu)自日本 Toyobo公司，該載體系統(tǒng)由含有 H1 啟動(dòng)子和可調(diào)控 GFP 表達(dá)的EF1-alpha 啟動(dòng)子的pLVTHM-GFP 質(zhì)粒，以及含有病毒包裝所必需元件的pRsv-REV、pMDlg-pRRE和pMD2G 質(zhì)粒組成。

1.1.2 主要試劑與儀器 總RNA提取試劑（Trizol Reagent）購(gòu)自日本 TaKaRa公司；第一鏈cDNA 合成試劑盒（ReverTra Ace-α First Strand cDNA Synthesis Kit）、Realtime-PCR 試劑盒（QPK-101）、T4 DNA 連接酶和LGK-100 核酸電泳儀均購(gòu)自日本 Toyobo公司；限制性內(nèi)切酶 MluI、ClaI購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌 E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司；100 bp DNA ladder（M-DNA-100 bp）購(gòu)自美國(guó) Axygen公司；恒溫水浴鍋和Fine-do X1 數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司；Eppendorf RealPlex4 Realtime-PCR 儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；其他生化試劑均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.2 ERβ-shRNA 慢病毒載體的構(gòu)建 將合成的DNA Oligo 稀釋后退火形成 shRNA 雙鏈DNA，與pLVTHM-GFP 質(zhì)粒分別用 MluI、ClaI雙酶切后，以 T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，篩選后抽提質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定。

取鑒定正確的pLVTHM-GFP/ERβ-shRNA 重組質(zhì)粒 20 μg，與pRsv-REV 10 μg、pMDlg-pRRE 15 μg、pMD2G 7.5 μg 混合后轉(zhuǎn)染 hMG63 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為空白載體組、空白對(duì)照組和ERβ-siRNA組，轉(zhuǎn)染 48 h 后在倒置熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) ERβshRNA 轉(zhuǎn)染 hMG63 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 目的基因干擾效率的檢測(cè) 按 Trizol Reagent 說明書的步驟，抽提各組細(xì)胞的Total RNA，利用第一鏈 cDNA 合成試劑盒（ReverTra Ace-α First Strand cDNA Synthesis Kit）經(jīng) RT-PCR生成相應(yīng)的cDNA。以各組cDNA 作為模板，根據(jù) Realtime-PCR 試劑盒說明書，利用兩步法進(jìn)行Realtime-PCR，目標(biāo)片段擴(kuò)增引物 ERβPf和ERβPr的序列分別為（位于242～392 bp）：5’ CAACACCT GGGCACCTTT 3’和5’ TTCCCACTAACCTTCCT TTT 3’，退火溫度為59 ℃，延伸循環(huán)數(shù)為45。

根據(jù)相對(duì)定量法計(jì)算目標(biāo)片段的擴(kuò)增比例，mRNA的相對(duì)變化量公式為：Ratio=2-△△Ct，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴(kuò)增產(chǎn)物以 2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行觀察。以 18S RNA 作為內(nèi)參，各樣本重復(fù) 3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS11.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組目的基因干擾效率的比較采用方差分析，以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERβ-shRNA 轉(zhuǎn)染 hMG63的效果

pLVTHM-GFP/ERβ-shRNA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hMG63 細(xì)胞 48 h 后，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果，ERβ-siRNA組hMG63 細(xì)胞 90% 以上呈現(xiàn)綠色熒光（GFP），而空白對(duì)照組和空白載體組細(xì)胞基本無熒光（圖 1）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，ERβ-shRNA 轉(zhuǎn)染 hMG63 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為92.3%（圖 2）。

圖1 ERβ-shRNA 轉(zhuǎn)染 hMG63 細(xì)胞 48 h 后的轉(zhuǎn)染效果 倒置熒光顯微鏡×100（A：空白對(duì)照組；B：空白載體組；C：ERβ-siRNA組）Figure1 The transfection effect of hMG63 cells transfected with ERβ-shRNA after 48 hours (Inverted fluorescence microscope×100).A: Control group; B: Blank vector group; C: ERβ-siRNA group.

圖2 ERβ-shRNA 轉(zhuǎn)染 hMG63 細(xì)胞效率的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Figure2 The transfection efficiency of hMG63 cells transfected with ERβ-shRNA by flow cytometry

2.2 ERβ 沉寂表達(dá)的效果

ERβ 表達(dá)量表達(dá)差異倍數(shù)用 1.993ˇ－△△Ct表示，結(jié)果表明，ERβ-siRNA組ERβ 表達(dá)量（0.17±0.01）僅約為空白載體組（1.00±0.01）的17.3%（P＜0.001）；ERβ-siRNA 對(duì) hMG63 細(xì)胞ERβ 基因的抑制效率約為83%（圖3）。

圖3 ERβ-shRNA 轉(zhuǎn)染 hMG63 細(xì)胞后ERβ的沉寂表達(dá)效果（a P＜0.001）Figure3 The silence expression effect of hMG63 cells transfected with ERβ-shRNA.aP＜0.001.

3 討論

RNAi 技術(shù)通過雙鏈 RNA 引發(fā)轉(zhuǎn)錄后沉默，產(chǎn)生 RNAi 現(xiàn)象[4]。該技術(shù)具有高度的序列專一性，可使特定基因不表達(dá)或低表達(dá)，比反義RNA技術(shù)和同源共抑制更有效，更容易產(chǎn)生功能喪失或降低突變，目前已經(jīng)成功地對(duì)上百種哺乳動(dòng)物細(xì)胞目的基因進(jìn)行功能分析，從而成為一種抑制體細(xì)胞功能基因翻譯表達(dá)的有效手段[5]。選擇性地抑制成骨細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)的ERβ亞型，可有效地分析是否該亞型介導(dǎo)了 DHEA 對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和抗凋亡作用及其具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

2 種ER亞型獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，以及不同的組織分布，是靶組織對(duì)配體反應(yīng)的重要決定因素。ER的配體不只是雌激素，還可與DHEA等雄激素結(jié)合。雖然 DHEA 與ER的結(jié)合力較雌激素與ER的結(jié)合力低數(shù)個(gè)能量級(jí)，但體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在經(jīng)典 ER 存在時(shí)，DHEA 可直接激活雌激素應(yīng)答元件（ERE），而不依賴其向雌二醇（E2）轉(zhuǎn)化[6]。綜合 DHEA 抑制破骨的作用，有學(xué)者認(rèn)為DHEA 可能直接作用于成骨細(xì)胞的ERβ，通過促進(jìn) OPG的表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞的噬骨作用[7]。

在本研究中，我們利用慢病毒載體（pLVTHM）介導(dǎo) ERβ-siRNA 轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞 hMG63，結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)染效率為92.3%；ERβ-siRNA 抑制 ERβ 表達(dá)的效率為83% 左右，充分滿足了在ERβ 缺失或低表達(dá)時(shí)，研究成骨細(xì)胞功能的需要。

綜上，本研究成功建立了 ERβ 沉寂表達(dá)的成骨細(xì)胞模型，滿足了研究成骨細(xì)胞中 ERβ 相關(guān)功能的需要，為了解 ERβ 介導(dǎo) DHEA 防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制提供了平臺(tái)。

[1]Wang YD, Li DJ.The family of estrogen receptor and related co-factors.Foreign Med Sci Section Endocr, 2004, 24 Suppl:57-59.(in Chinese)王玉東, 李大金.雌激素受體家族及其相關(guān)的輔助因子.國(guó)外醫(yī)學(xué).內(nèi)分泌學(xué)分冊(cè), 2004, 24(增刊):57-59.

[2]Wang YD, Tong JQ, Luo LM, et al.Up-regulation of ERbeta in murine osteoblasts with the action of dehydroepiandrosterone.Chin Pharm J, 2006, 41(7):509-512.(in Chinese)王玉東, 童劍倩, 羅來敏,等.脫氫表雄酮對(duì)成骨細(xì)胞ERbeta的上調(diào)節(jié)作用.中國(guó)藥學(xué)雜志, 2006, 41(7):509-512.

[3]Paech K, Webb P, Kuiper GG, et al.Differential ligand activation of estrogen receptors ERalpha and ERbeta at AP1 sites.Science, 1997,277(5331):1508-1510.

[4]Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, et al.RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals.Cell, 2000, 101(1):25-33.

[5]Morita T, Yoshida K.RNAi provides a new tool for functional analyses of the mammalian genes.Tanpakushitsu Kakusan Koso, 2002,47(14):1839-1845.

[6]Kousteni S, Bellido T, Plotkin LI, et al.Nongenotropic,sex-non-specific signaling through the estrogen or androgen receptors:dissociation from transcriptional activity.Cell, 2001, 104(5):719-730.

[7]Wang YD, Wang L, Li DJ, et al.Dehydroepiandrosterone inhibited the bone resorption through the upregulation of OPG/RANKL.Cell Mol Immunol, 2006, 3(1):41-45.