袁捷，劉廣鵬，韋敏，祁佐良，崔磊，曹誼林

修復因創(chuàng)傷、感染、腫瘤等導致的下頜骨缺損是臨床常見疾病，自體骨移植是目前療效最佳的治療手段，但因患者不但需承受自身供區(qū)的明顯損傷，供區(qū)來源也受限，同時也存在創(chuàng)口感染、血腫形成、取骨區(qū)疼痛等諸多并發(fā)癥[1-2]，所以在整復外科領域，目前下頜骨缺損的修復仍是難題。因此，尋找更好的下頜骨整復治療方法備受關注。

新興的組織工程技術有很多優(yōu)點，如良好恢復損傷組織正常結構和功能，支架材料可任意塑形且對供體部位損傷小，為修復下頜骨缺損提供了新的思路。所以應用組織工程技術修復承力下頜骨缺損是目前研究的熱點。

骨髓基質干細胞（bone marrow stromal cell，BMSC）已被證明是較好的種子細胞來源[3]。我們在前期已成功地應用成骨誘導 BMSC 分別復合珊瑚和珊瑚羥基磷灰石修復了犬下頜骨 3cm的節(jié)段缺損，與珊瑚組織工程骨相比，羥基磷灰石組織工程骨有較多材料殘留，修復效果相對較差[4-6]。就組織工程的目的而言，希望支架最終能隨新生組織的形成逐步降解，由此達到接近自然的良好修復。但珊瑚作為支架在組織工程骨內降解速率如何目前尚無定論。為此本實驗分別采用成骨誘導 BMSC復合珊瑚構建組織工程骨修復犬下頜骨 3cm的標準節(jié)段缺損，通過觀察比較此珊瑚組織工程骨在不同時間段支架材料降解情況確定其最終修復效果，為臨床應用提供進一步的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

地塞米松、β-磷酸甘油鈉、2-磷酸抗壞血酸和DMEM 培養(yǎng)液購自美國 Sigma公司；雜交犬購自上海交通大學農(nóng)學院；珊瑚為海南三亞產(chǎn)濱珊瑚。固定鈦板、鈦釘由常州康輝醫(yī)療器有限責任公司提供；μ80 顯微 CT（Micro-CT）為瑞士 Scanco medical公司產(chǎn)品；AG-1（Ver.3.80）生物力學測試儀為日本 Shimdzu公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 BMSC的分離、誘導培養(yǎng) 5%的戊巴比妥鈉（0.5ml/kg）麻醉 12只犬后，均抽取骨髓 3～4ml，PBS 洗滌，600×g 離心 5 min，去上層脂滴，4×104個有核細胞/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿中，加含有地塞米松（10 nmol/L）、β-磷酸甘油鈉（2.16 g/L）和2-磷酸抗壞血酸（37.5 mg/L）的成骨條件培養(yǎng)液，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。5d后PBS 洗去未貼壁細胞，更換培養(yǎng)液。待BMSC 大部分融合，0.25% 胰蛋白酶消化傳代，以0.5×104個細胞/cm2密度接種，培養(yǎng)至第 2 代接種珊瑚材料。

1.2.2 BMSC 細胞-珊瑚復合物的植入 12只成年雜交犬，分為2組，每組6只，體重 19～22 kg，術前 8周拔除右側上下全部前磨牙及第一磨牙預防感染；同時拔除左側上下全部前磨牙及第一磨牙，作為生物力學測試正常組，即對照組。5%的戊巴比妥鈉（0.5ml/kg）麻醉，術中靜脈滴注青霉素 160萬單位抗炎。右側臥位，頜下皮膚切開進入，暴露下頜骨體，置入鈦板，近遠中各 3 枚鈦釘固定，線鋸離斷形成 3cm節(jié)段缺損，去除骨膜，局部骨蠟填塞止血。隨后將誘導細胞 BMSC-珊瑚組珊瑚復合物植入缺損處，逐層關創(chuàng)。術后隔日起青霉素 80萬單位肌肉注射（每天 2 次×3 d），防止感染，并進流質（半流質）飼養(yǎng)。術后22周全部拆除鈦板。

1.2.3 節(jié)段缺損處的立體骨密度和珊瑚殘留率的測定 采用靜脈空氣栓塞處死術后12周和32周各 6只動物，鋸下雙側下頜骨標本，采用Micro-CT測定標本節(jié)段缺損處組織的立體骨密度（閾值設為25% 最大灰度值）和珊瑚殘留率（閾值設為46.5% 最大灰度值），掃描層厚度均為50μm×50 μm×50 μm。

1.2.4 大體形態(tài)結構、新骨形成和珊瑚降解的觀察 BMSC-珊瑚組犬術后12周和32周時，取材后各取 6只下頜骨觀察大體形態(tài)結構，隨后4%多聚甲醛固定標本，梯度酒精脫水，以聚甲基丙烯酸甲脂包埋，行包括連接處縱切面的硬組織切片，厚度 50 μm；之后行苦味酸-品紅（Van Gieson）染色，并采用組織形態(tài)測定法[5]定量觀察新骨形成和珊瑚降解情況。

1.2.5 生物力學的檢測 12周及32周時，BMSC-珊瑚組和對照組下頜骨標本各取 6只，以75% 酒精擦凈、吹干后，采用生物力學測試儀行整骨咬合向三點彎曲測試（以自凝義齒基托樹脂固位），跨距為30 mm，受力截面積設為長方形，位于植入物中央，加載速度 0.5mm/min，最大彎曲強度=3LF/（2WT2），彈性模量=L3F/（4WT3⊿l），其中 W 為寬度；T 為厚度；L 為跨距；F 為最大載荷；⊿l 為最大彎距。后兩者在三點彎曲實驗中測出。

1.3 統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)采用方差分析和Student t test 方法進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計軟件包為SAS Ver.6.12。

2 結果

所有犬術后傷口無感染，早期輕度腫脹。術后2 d開始進食流質，1周后進食半流質。

2.1 節(jié)段缺損處的立體骨密度和珊瑚殘留率

術后12周誘導 BMSC-珊瑚組新骨形成較好，剖面有孔隙結構出現(xiàn)，但仍可見支架結構明顯殘留；術后32周伴隨珊瑚材料逐步降解新骨進一步成熟，但與正常下頜骨比較，尚無明顯的下頜管腔形成（圖 1）。

圖1 術后立體骨密度和珊瑚殘留率的Micro-CT 圖像（A：BMSC-珊瑚組12周；B：BMSC-珊瑚組32周；C：自體對照組32周）Figure1 Micro-CT images of density of bone volume and residual material volume post- operation.A: BMSC-coral group at 12 weeks; B:BMSC-coral group at 32 weeks; C: The normal control group at 32 weeks.

術后12周骨組織的平均密度（density of bone volume，DBV）BMSC-珊瑚組為（562.76±85.68）mg HA/cm3顯著高于對照組[（474.04±86.85）mg HA/cm3，P＜0.05]。術后32周 BMSC-珊瑚組DBV（554.3±59.43）mg HA/cm3也顯著高于對照組[（469.36±67.74）mg HA/cm3，P＜0.05]。就支架殘留率（residual material volume，RMV）而言，BMSC-珊瑚組術后12周為（21.44±4.33）%，顯著高于術后32周的[（14.46±2.94）%，P＜0.01]。

2.2 大體形態(tài)結構、新骨形成和珊瑚降解

BMSC-珊瑚組12周和32周均可見骨缺損已較好修復，斷端處為骨樣連接（圖 2）。Van Gieson染色顯示術后12周誘導 BMSC-珊瑚組已形成良好骨組織，有類哈弗系統(tǒng)結構形成，珊瑚支架材料有較多殘留；術后32周可見骨進一步成熟形成板層骨結構，且珊瑚支架材料有較多降解（圖 3）。通過圖像分析可知，BMSC-珊瑚組術后32周新骨量為（60.66±8.09）%，顯著高于術后12周的[（46.74±5.17）%，P＜0.05]，RMV 術后12周為（24.17±5.44）%，則顯著高于術后32周的[（11.63±3.29）%，P＜0.01]，與Micro-CT 檢測結果一致。

圖2 術后BMSC-珊瑚組下頜骨標本的大體形態(tài)結構（A：12周；B：32周）Figure2 Gross view of repaired mandibles post-operation in BMSC-coral group.A: 12 weeks; B: 32 weeks

圖3 采用組織學 Van Gieson 染色方法觀察術后BMSC-珊瑚組新骨形成和珊瑚降解情況（A.：12周；B：32周）（100×）Figure3 Using Van Gieson’s Picro-fuchsine staining to observe the new bone formation and coral degradation post-operation.A: at 12 weeks; B: I 32 weeks (100×)

2.3 生物力學

術后12周時，BMSC-珊瑚組最大載荷為（1.74±0.37）KN，達到對照組的73.5%；BMSC-珊瑚組最大彎曲強度為（33.43±9.47）MPa，達到對照組的81.67%；均無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。術后32周時，BMSC-珊瑚組最大載荷為1.52±0.42 KN，達到對照組的86.37%；BMSC-珊瑚組最大彎曲強度為（54.4±9.88）MPa，達到對照組的90.8%，兩者之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。術后12周 BMSC-珊瑚組彈性模量顯著高于對照組（P＜0.05），而 BMSC-珊瑚組術后32周最大彎曲強度顯著高于術后12周（P＜0.05），表明BMSC-珊瑚組下頜骨隨時間延長珊瑚材料逐步降解，其力學強度也有顯著提高（表1）。

表1 術后下頜骨標本各項生物力學測試參數(shù)Table1 Biomechanical analyses of repaired mandibles at 12 and 32 weeks post-operation

3 討論

本實驗采用珊瑚作為細胞載體，一方面是因為珊瑚的孔隙率符合成骨細胞的寄居要求，另一方面珊瑚的力學強度較高，具有與松質骨相類似的力學性能，有較高的壓應力（可達 6 MPa），可以滿足承力骨要求[7]，且其有較好的降解性，這對組織工程骨尤為重要，因降解緩慢的材料在骨修復過程中會占據(jù)新骨形成空間，并產(chǎn)生應力遮擋作用，從而影響骨愈合。在我們先前實驗中，雖已應用珊瑚復合成骨 BMSC 構建了組織工程下頜骨，但具體材料降解速率尚需進一步明確。本實驗中通過Micro-CT 檢測發(fā)現(xiàn)珊瑚組織工程骨支架殘留率術后32周較 12周顯著減少（殘留率 11%～15%）；組織學圖像分析也進一步加以證實，而生物力學強度則隨時間增長顯著增強（術后32周達到正常組的90.8%），提示我們珊瑚支架材料配合新骨形成逐步降解，最終下頜骨達到了較好修復。

單純珊瑚在體內 3個月完全降解吸收，與我們先前的實驗結果也相符合[7-8]。就復合 BMSC 修復骨缺損而言，珊瑚的降解速率卻有所不同。Petite等[9]在修復羊跖骨標準缺損時發(fā)現(xiàn)術后16周珊瑚殘留率 2%，而 Geiger等[10]在修復兔橈骨標準缺損時發(fā)現(xiàn)術后16周時珊瑚殘留率 6%。本實驗中術后12周珊瑚殘留率 （21.44±4.33）%，術后32周 殘留（14.46±2.94）%，組織學圖像分析結果也基本與之相符。造成珊瑚材料降解速率不同的原因可能與修復部位不同有關，前二者都為負重骨缺損，相對承力較下頜骨更高，較高的受力強度造成局部材料降解速度也較快[11-12]。

此外，同樣是可降解的多孔磷酸三鈣材料，由于其初始強度較低（2MPa 左右），我們在修復同樣犬下頜骨缺損時，曾發(fā)現(xiàn)單純材料組有 1 例早期斷裂，提示我們應用此材料構建組織工程骨修復大塊骨缺損時早期仍要承擔一定的風險。此外，磷酸三鈣材料降解較慢，術后32周仍有較多材料殘留，長期而言新骨質量比大部分降解的珊瑚材料組織工程骨稍差[13]。

綜上所述，術后下頜骨中珊瑚支架殘留率隨時間延長逐漸降低，而生物力學強度則隨時間延長顯著增強，達到了較好的修復效果；其具體參數(shù)的明確也為臨床應用組織工程技術修復頜面承力骨缺損進一步提供了有益的例證。

[1]Younger EM, Chapman MW.Morbidity at bone graft donor sites.J Orthop Trauma, 1989, 3(3):192-195.

[2]Hadlock TA, Vacanti JP, Cheney ML.Tissue engineering in facial plastic and reconstructive surgery.Fac Plast Surg, 1998, 14(3):197-203.

[3]Oreffo RO, Triffitt JT.Future potentials for using osteogenic stem cells and biomaterials in orthopedics.Bone, 1999, 25(2 Suppl):5S-9S.

[4]Yuan J, Zhu L, Wang M, et al.Repair of canine segmental mandibular defects using autogenous bone marrow stromal cells and coralline hydroxyapatite.Chin J Stomatol, 2006, 41(2):94-97.(in Chinese)袁捷, 祝聯(lián), 王敏,等.自體骨髓基質干細胞-珊瑚羥基磷灰石修復下頜骨節(jié)段缺損的實驗研究.中華口腔醫(yī)學雜志, 2006, 41(2):94-97.

[5]Yuan J, Liu GP, Chai G, et al.Pilot study of using autologous bone marrow stromal cells and coral to repair canine segmental mandibular defects.Chin J Plast Surg, 2007, 23(1):51-55.(in Chinese)袁捷, 劉廣鵬, 柴崗,等.自體骨髓基質干細胞復合珊瑚修復犬下頜骨節(jié)段缺損的初步研究.中華整形外科雜志, 2007, 23(1):51-55.

[6]Yuan J, Yin DM, Wang M, et al.Experimental study of subcutaneous osteogenesis by canine bone marrow stromal cells and coralline hydroxyapatite.China J Oral Maxillofacial Surg, 2005, 3(3):207-211.(in Chinese)袁捷, 殷德民, 王敏,等.犬骨髓基質干細胞復合珊瑚羥基磷灰石皮下成骨的實驗研究.中國口腔頜面外科雜志, 2005, 3(3):207-211.

[7]Zhu L, Cui L, Wang M, et al.Experimental study of composite of coral and mesenchymal stem cells to repaire femoral defect.Chin J Orthop, 2003, 23(8):483-488.(in Chinese)祝聯(lián), 崔磊, 王敏,等.應用珊瑚及骨髓基質干細胞復合物修復股骨缺損的實驗研究.中華骨科雜志, 2003, 23(8) 483-488.

[8]Sciadini MF, Dawson JM, Johnson KD.Evaluation of bovine-derived bone protein with a natural coral carrier as a bone-graft substitute in a canine segmental defect model.J Orthop Res, 1997, 15(6):844-857.

[9]Petite H, Viateau V, Bensa?d W, et al.G.Tissue-engineered bone regeneration.Nat Biotechnol, 2000, 18(9):959-963.

[10]Geiger F, Lorenz H, Xu W, et al.VEGF producing bone marrow stromal cells (BMSC) enhance vascularization and resorption of a natural coral bone substitute.Bone, 2007, 41(4):516-522.

[11]Lanyon LE.Using functional loading to influence bone mass and architecture: objectives, mechanisms, and relationship with estrogen of the mechanically adaptive process in bone.Bone, 1996, 18(1 Suppl.): 37S-43S.

[12]Handschel J, Wiesmann HP, Stratmann U, et al.TCP is hardly resorbed and not osteoconductive in a non-loading calvarial model.Biomaterials, 2002, 23(7):1689-1695.

[13]Yuan J, Cui L, Zhang WJ, et al.Repair of canine mandibular bone defects with bone marrow stromal cells and porous beta-tricalcium phosphate.Biomaterials, 2007, 28(6):1005-1013.