李應(yīng)國，趙旭博，張雷，李賢良，郗存顯，王國民，王雄，果旗，李正國

（1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400044；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊凌 712100；3.重慶市進(jìn)出口食品安全工程技術(shù)研究中心，重慶 400020；4.北京中檢維康技術(shù)有限公司，北京 100044）

免疫親和柱-高效液相色譜法檢測乳制品中氯霉素

李應(yīng)國1，3，趙旭博2，張雷3，李賢良3，郗存顯3，王國民1，3，王雄4，果旗4，李正國1

（1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400044；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊凌 712100；3.重慶市進(jìn)出口食品安全工程技術(shù)研究中心，重慶 400020；4.北京中檢維康技術(shù)有限公司，北京 100044）

建立免疫親和柱富集凈化、高效液相色譜-紫外法快速測定牛奶和奶粉中氯霉素殘留物。樣品用乙酸乙酯提取，經(jīng)免疫親和色譜柱純化，應(yīng)用液相色譜-紫外法檢測。結(jié)果表明，牛奶和奶粉添加氯霉素，回收率為79.6%～108.6%，變異系數(shù)小于10%；方法檢測靈敏度0.1 μg/L。該方法能夠特異性的純化牛奶和奶粉樣品中的氯霉素，免疫親和柱（IAC）凈化是一種簡單，快速，準(zhǔn)確的方法。

氯霉素殘留物檢測；免疫親和柱凈化富集；液相色譜-紫外法；牛奶

0 引言

氯霉素是一種常用的具有旋光活性的廣譜抗生素，治療畜禽腸道感染有特效，至今已有50年的使用歷史[1]。

氯霉素的抗菌效果雖然很好，但它的副作用很大，1999年9月13日農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》的通知，規(guī)定了氯霉素在所有食品動(dòng)物的可食用組織中不得檢出[2]。目前，氯霉素的測定方法有高效液相色譜法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、酶免疫檢測法等[3]。本文研究了免疫親和柱凈化高效液相色譜-紫外法測定牛奶和奶粉中的氯霉素殘留量，該方法具有簡單，快速，準(zhǔn)確，靈敏度高等特點(diǎn)。

1 材料和方法

（1）儀器。高效液相色譜儀（HITACHI），紫外檢測器（HITACHI），高速離心機(jī)，泵流操作架。

（2）主要試劑。氯霉素免疫親和柱；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品。

（3）液相色譜條件：色譜柱為Cloversil-C18，4.6× 150 mm（5 um），流動(dòng)相為甲醇:水=50∶50（體積比），流速為0.8 mL/min。檢測器為紫外檢測器，波長278 nm，進(jìn)樣體積為50～100 uL。

（4）氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。標(biāo)準(zhǔn)品用流動(dòng)相配制，質(zhì)量濃度分別為2，5，10，20，50 μg/L，注入液相色譜檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.1 樣品處理方法

1.1.1 牛奶[5]

（1）準(zhǔn)確量取牛奶樣品20 mL，準(zhǔn)確加入20.0 mL乙酸乙酯，搖床震蕩提取30 min，然后以轉(zhuǎn)速4000 r/min離心10 min。

（2）準(zhǔn)確吸取上清液10.0 mL，于60℃氮?dú)庀麓蹈?，然后?0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%乙腈水復(fù)溶，用玻璃纖維濾紙過濾；收集濾液于干凈燒杯中。

（3）將上述濾液10.0 mL（10.0 mL樣品），以1滴/s的流速全部通過氯霉素免疫親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱，隨后用10.0 mL純水以1～2滴/秒的流速淋洗親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱。

（4）將玻璃小管置于親和柱下，用1.0 mL甲醇以1滴/秒淋洗親和柱，將所有樣品淋洗液收集于玻璃測試管中，于60℃氮?dú)庀麓蹈桑缓笥昧鲃?dòng)相定容500 μL，注入HPLC檢測。

1.1.2 奶粉

準(zhǔn)確稱取5 g奶粉，加入50 mL溫水（50℃）溶解，充分混勻。然后按照1.5.1牛奶的試驗(yàn)方法操作。

1.2 添加回收實(shí)驗(yàn)

分別選擇牛奶和奶粉樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，牛奶樣品分別添加質(zhì)量濃度為0.5，1，2 μg/L 3個(gè)梯度；奶粉樣品分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5，10，20 ng/g 3個(gè)梯度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做5組平行試驗(yàn)，計(jì)算回收率和變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與色譜圖

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為2，5，10，20，50 μg/L建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=532x-54，R2= 0.9999，氯霉素質(zhì)量濃度為10 μg/L色譜如圖2所示。

2.2 樣品添加回收率

牛奶和奶粉樣品添加回收率結(jié)果：牛奶樣品回收率在79.6%～108.6%之間，變異系數(shù)小于10%，結(jié)果如表1所示。奶粉樣品回收率在79.8%～107.2%之間，變異系數(shù)小于10%，結(jié)果如表2所示。

表1 牛奶添加回收率結(jié)果

表2 奶粉添加回收率結(jié)果%

本研究中，免疫親和柱富集凈化方法，能夠很大的提高樣品的檢測靈敏度，牛奶樣品濃縮了20倍，奶粉樣品濃縮了2倍。實(shí)驗(yàn)中液相色譜靈敏度能夠達(dá)到2 μg/L，因此，本研究方法，牛奶的檢測靈敏度為0.1 μg/L，奶粉的檢測靈敏度為1.0 ng/g。

牛奶樣品中添加質(zhì)量濃度為1.0 μg/L檢測色譜如圖3所示。

3 結(jié)論

本研究建立的免疫親和柱富集凈化-高效液相色譜-紫外法檢測牛奶和奶粉中氯霉素殘留量，樣品前處理簡單，免疫親和層析凈化富集效果明顯，很大的提高了樣品的檢測靈敏度，牛奶樣品的靈敏度為0.1 μg/L，奶粉樣品的靈敏度為1 ng/g；樣品添加回收率在79.6%～108.6%之間，變異系數(shù)小于10%；該方法適用于牛奶和奶粉中的氯霉素的快速檢測。

[1]胡頂飛,沈建忠.氯霉素類抗生素的殘留分析[J].中國獸藥雜志，2001，35(5)：55-57.

[2]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.關(guān)于下達(dá)2001年獸藥殘留監(jiān)控計(jì)劃的通知[J].獸醫(yī)公報(bào)，2001，3(6)：13-14.

[3]劉智宏.酶標(biāo)免疫測定法在檢測動(dòng)物性食品中氯霉素殘留的應(yīng)用[J].中國獸藥雜志，1995，29(2)：47-48.

[4]陳家華.高效液相色譜快速測定家禽組織中氯霉素殘留研究[J].中國抗生素雜志，1992，17(5)：351-355.

[5]ALLEN E H.Review of Chromatographic Methods for Chloramphenicol Residues in Milk,Egg,and Tissues from Food Producing Animal[J].J.Assoc off Anal Chem,1985,68：990-999.

[6]HAMBURGER R N.Chloramphenicol-Specific Antibody[J].Science,1966,152:203-205.

[7]ANNA Y K,JEANNE V S.Competitive ELISA of Chloramphenicol: Influence of Immunoreagent Structure and Application of the Method for the Inspection of Food of Animal Origin[J].Food and Agricultural immunology，2000，12：115-125.

[8]王桂枝，石德石.氯霉素免疫原的合成與鑒定[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1998，18(2)：163-167.

Rapid method for the determination of chloramphenicol in milk and powder milk by immunoaffinity column clean-up and HPLC-UV

LI Ying-guo1,3,ZHAO Xu-bo2,ZHANG Lei3,LI Xian-liang3,XI Cun-xian3, WANG Guo-min1,3,WANG Xiong4,GUO Qi4,LI Zheng-guo1
(1.College of Bioengineering,Chongqing University,Chongqing 400044,China;2.Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry,Yangling,Shanxi 712100,China;3.Chongqing Engineering Research Center for Import and Export Food Safety,Chongqing 400020,China;4.Clover Technology Group Inc,Beijing 100044,China)

A simple and rapid method for determination Chloramphenicol（CAP）content in Milk and Powder Milk clean up by immunoaffinity column and determination by HPLC was developed.After extraction with ethyl acetate，the extracts of samples was loaded on the IAC column for purification and determined by HPLC.The recoveries of samples were in the range of 79.6%～108.6%,the RSD was below 10%.The limit of quantification for CAP was 0.1 ng/mL.Determination CAP content in Milk and Powder Milk clean up by immunoaffinity column was a rapid，simple and exact method.

Chloramphenicol；immunoaffinity column；HPLC；Milk

TS252.7

A

1001-2230（2011）04-0053-02

2011-01-17

重慶市科委資助項(xiàng)目（CSTC2009CB1012）。

李應(yīng)國（1965-），男，高級(jí)獸醫(yī)師，從事食品安全檢測技術(shù)研究。

李正國