孫盈，黃金海，李瑩，賈程坤，高嵽，劉陽(yáng)，魯珂成

（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072）

耐熱型復(fù)合乳酸菌凍干保護(hù)劑的研究

孫盈，黃金海，李瑩，賈程坤，高嵽，劉陽(yáng)，魯珂成

（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072）

為獲得對(duì)于混合乳酸桿菌最佳的耐熱凍干保護(hù)劑配方，考察了不同凍干劑單因子添加物及5種凍干保護(hù)劑配方對(duì)冷凍干燥后乳酸菌的存活率、耐熱性能，失水情況和感官指標(biāo)，利用中心組合響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)，獲得以活菌率，耐熱性和失水率為控制指標(biāo)的保護(hù)劑組分優(yōu)化的多元二次方程，并進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果表明，通過(guò)初步篩選獲得感官良好、復(fù)溶后相容性好的凍干介質(zhì)，進(jìn)一步條件優(yōu)化得到最佳配方。最佳凍干保護(hù)劑配方為脫脂乳10%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)5%，海藻糖5%，維生素C為0.5%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），此時(shí)凍干后活菌率的預(yù)測(cè)值可達(dá)到93.05%，37℃保存10 d后活菌率預(yù)測(cè)值可達(dá)到77.26%，具有較好的耐熱性能。

乳酸菌；凍干保護(hù)劑；中心組合設(shè)計(jì)；耐熱性

0 引言

近年來(lái)，隨著人們消費(fèi)水平的提高和健康理念的改善，發(fā)酵乳制品的關(guān)注度不斷得到提升，直投式酸奶發(fā)酵劑因其活力強(qiáng)、含菌量高、菌量穩(wěn)定，保存期長(zhǎng)、耐儲(chǔ)運(yùn)，使用方便，發(fā)酵產(chǎn)品穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)而成為了研發(fā)熱點(diǎn)[1]。作為提升發(fā)酵劑活力的關(guān)鍵工藝，凍干保護(hù)劑能有效防止細(xì)菌細(xì)胞死亡，保證活菌量和延長(zhǎng)菌種保藏期。我國(guó)酸乳市場(chǎng)廣闊，研制滿足規(guī)模化及自制酸乳等多元化市場(chǎng)需求，適應(yīng)不同冷鏈流通的耐熱凍干保護(hù)劑酸乳菌種具有重要意義[2，3]。本文通過(guò)活菌計(jì)數(shù)，耐熱性，凍干劑外觀及相容性評(píng)價(jià)等指標(biāo)的分析，對(duì)復(fù)合凍干保護(hù)劑配方進(jìn)行篩選研究，以期為發(fā)酵劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)[4，5]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

保加利亞乳酸桿菌A株，嗜熱鏈球菌S株，嗜酸乳桿菌CL10株，鼠李糖乳酸桿菌L3株，均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%脫脂乳，MRS液體培養(yǎng)基，HHD固體培養(yǎng)基，滅菌0.5%NaCl溶液，按文獻(xiàn)配制；蔗糖，海藻糖，明膠，谷氨酸鈉，維生素C，聚乙二醇（PEG6000），聚乙烯吡咯烷酮（PVP30），山梨醇均為生物純或化學(xué)純。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的培養(yǎng)

將37℃過(guò)夜培養(yǎng)的乳桿菌、嗜熱鏈球菌、CL10及L3菌培養(yǎng)物，以終濃度2%分別接種含1%脫脂乳MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后分別取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。其余培養(yǎng)菌分別以5 000 r/min離心10 min，菌泥稱重后加入適量MRS懸浮，再按一定體積比混合制備復(fù)合乳酸菌劑。

1.2.2 復(fù)合乳酸菌保護(hù)劑效果的檢測(cè)

設(shè)置不同的凍干劑組方，將上述菌液與不同凍干劑等體積混合，混勻后分裝于青霉素瓶中，每瓶2 mL,每組5個(gè)重復(fù)。各組樣品置-40℃的冰箱中預(yù)冷4 h，然后于預(yù)冷的冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥16～18 h。凍干過(guò)程中觀察不同凍干劑組水分升華快慢情況，待全部樣品冷凍干燥充分后，取出樣品，進(jìn)行失水率及活菌計(jì)數(shù)等指標(biāo)的測(cè)定：

（1）凍干后失水率Y3=（凍干前菌質(zhì)量-凍干后菌質(zhì)量）/凍干前菌質(zhì)量×100%；

（2）凍干后活菌率Y1=凍干后菌數(shù)/凍干前活菌數(shù)×100%；

（3）各組樣品置37℃溫箱放置10 d后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算耐熱處理后的活菌率Y2，Y2=37℃，10 d后活菌數(shù)/凍干前活菌數(shù)×100%；

（4）凍干菌粉外觀感官指標(biāo)評(píng)價(jià)分級(jí)如表1所示。

微寫作不同于傳統(tǒng)作文。它沒(méi)有篇幅、體裁和格式的具體限定；它相對(duì)于傳統(tǒng)作文來(lái)說(shuō)是一種作文的升華，避免了傳統(tǒng)寫作中為考試而寫作的弊端，使得作文變得更加生動(dòng)靈活，且融入學(xué)生更多有趣的靈魂和真實(shí)情感。它的重點(diǎn)都集中在一個(gè)“微”字上，既可以是外在的微，也可以是內(nèi)容上的微；它既沒(méi)有傳統(tǒng)記敘文對(duì)時(shí)間、地點(diǎn)、人物、事件的限定，也沒(méi)有議論文對(duì)論點(diǎn)、論據(jù)的規(guī)定，更沒(méi)有小說(shuō)對(duì)人物、情節(jié)、環(huán)境的要求；它切實(shí)將學(xué)生視為微寫作的主體，讓學(xué)生更愿意主動(dòng)表達(dá)自己的情感和觀點(diǎn)。

表1 凍干菌粉感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

凍干菌粉感官評(píng)價(jià)總分為30分：得分24分以上為優(yōu)質(zhì)凍干菌粉，27分以上為特優(yōu)，20分以上到24分為良好凍干乳粉，16分以上至20分為合格凍干乳粉，16分及以下為劣質(zhì)凍干乳粉。

1.2.3 耐熱凍干保護(hù)劑篩選

（1）在以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%脫脂乳MRS的基礎(chǔ)上，分別選擇加入7%的PEG6000，7%的PVP30，2%～4%甘油，10%淀粉，7%谷氨酸鈉作單因素凍干劑實(shí)驗(yàn)，使總菌量達(dá)3×1013mL-1，冷凍干燥后，感官指標(biāo)評(píng)價(jià)選擇外觀，復(fù)溶性快速、均勻的原料做進(jìn)一步研究。

（2）幾種復(fù)合保護(hù)劑的相容性比較。保護(hù)劑配方：保護(hù)劑A（10%脫脂乳和8%蔗糖，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），保護(hù)劑B（8%脫脂乳、2.4%明膠、2%海藻糖、5%蔗糖，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），保護(hù)劑C（10%脫脂乳，5%海藻糖，1%谷氨酸鈉，2%維生素C，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），保護(hù)劑D（8%脫脂乳，7%聚乙烯吡咯烷酮，2%海藻糖，5%蔗糖，0.2%山梨醇，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），保護(hù)劑E（10%脫脂乳，5%葡萄糖，1%谷氨酸鈉，2%維生素C，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

（3）幾種添加物對(duì)耐熱凍干保護(hù)劑的影響。參考前期5種復(fù)合保護(hù)劑的綜合評(píng)價(jià)情況，選擇脫脂乳、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、維生素C（Vc）4個(gè)因素、3個(gè)水平，其他固定添加因子分別為4%蔗糖、1%葡萄糖和1%谷氨酸鈉，利用軟件Design-Expert 8.0.4，選擇響應(yīng)面分析法(Response Surface)的中心組合設(shè)計(jì)(Central Composite Design)進(jìn)行方案設(shè)計(jì)和試驗(yàn)實(shí)施。

中心組合方式(Face Centered)α=1.0?；貧w模型為二次方程形式。通過(guò)凍干后活菌率Y1,37℃放置10 d后活菌率Y2，凍干后失水率Y33個(gè)指標(biāo)的比較，評(píng)價(jià)耐熱凍干保護(hù)劑的效果。選擇以獲得凍干后活菌率Y1，耐熱處理Y2為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，在等權(quán)重系數(shù)時(shí)，根據(jù)Design Expert軟件最優(yōu)解計(jì)算法，獲得修正后的最佳耐熱凍干保護(hù)劑理想組方。

2 結(jié)果

2.1 不同乳酸菌的培養(yǎng)

將培養(yǎng)的保加利亞乳酸桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳酸桿菌分別離心，菌泥稱重，MRS懸浮后，按適當(dāng)?shù)幕罹?，配制成總菌量?2×1013mL-1備用。

2.2 不同單因素添加物對(duì)凍干外觀的影響

單因素試驗(yàn)中，添加7%PEG6000，PVP30，甘油后的實(shí)驗(yàn)組，凍干過(guò)程明顯延長(zhǎng)，而且凍干后樣品聚縮在一起，難溶性增加；添加淀粉的凍干樣品，均一性，色澤較佳。

2.3 5組復(fù)合保護(hù)劑的結(jié)果比較

不同保護(hù)劑凍干菌的失水率如圖1所示。

由圖1可以得出，凍干菌粉失水率比較B＞A＞C＞E＞D。冷凍過(guò)程中觀察凍存瓶的水分升華線得到干燥速度的順序?yàn)镋＞D＞A≈C＞B。

凍干菌粉感官指標(biāo)如表2所示。由表2可以看出，凍干菌粉外觀綜合比較為A＞B＞D＞E＞C。

表2 凍干菌粉感官指標(biāo)評(píng)分

活菌記數(shù)結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，凍干后菌種活率比較E＞C＞B＞A＞D；37℃保存10 d后菌種活率比較為D＞C＞A＞B＞E。

表3 凍干及耐熱處理后活菌記數(shù)結(jié)果

表4 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果%

2.4 不同添加物對(duì)耐熱凍干保護(hù)效果的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表4所示。

利用Design Expert軟件對(duì)凍干保護(hù)劑響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得凍干后活菌率（Y1）、37℃10 d后活菌率(Y2)以及失水率(Y3)的預(yù)測(cè)值對(duì)自變量脫脂乳(A)、海藻糖(B)、PVP(C)和Vc(D)的多元回歸方程分別為

由表5可以看出，除凍干后活菌率指標(biāo)方程差異顯著外，37℃（10 d）后活菌率和失水率指標(biāo)方程差異均為極顯著，說(shuō)明3個(gè)指標(biāo)與所選因素之間存在顯著的回歸關(guān)系。PVP的加入，對(duì)乳酸菌凍干過(guò)程的成活率，耐熱性及凍干的失水率都有顯著影響。在耐熱性方面，不同添加物之間有較顯著的影響，適量Vc的加入有助于改善乳酸菌保護(hù)劑的耐熱性能。

以獲得凍干前后活菌率、37℃處理10 d后耐熱性為主要指標(biāo)，等權(quán)重條件下獲得了修正后的最佳耐熱凍干保護(hù)劑組方：脫脂乳10%，PVP5%，海藻糖5%，維生素C 0.5%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），此時(shí)凍干后活菌率的預(yù)測(cè)值可達(dá)到93.05%，37℃保存10 d后活菌率預(yù)測(cè)值可達(dá)到77.26%。

3 討論

發(fā)酵酸乳市場(chǎng)需求大，優(yōu)良及高活菌率的直投式乳酸菌菌種的研究成為熱點(diǎn)。食品耐熱凍干保護(hù)劑的研究，除具有良好的外觀、凍干組分安全無(wú)毒，加水后復(fù)溶性好等優(yōu)點(diǎn)外，保持凍干后高活菌率及活菌維持時(shí)間，即具有良好的耐熱性能，才能滿足理想凍干保護(hù)劑的要求。本研究所選用了作用機(jī)制不同的凍干保護(hù)劑組分，從凍干后外觀，復(fù)溶能力，凍干菌粉的持水性能，凍干后活菌率，凍干菌耐熱性能等方面探討凍干劑組分的相互作用，并篩選優(yōu)化復(fù)合乳酸菌凍干組方。

研究中選用了天然及合成的高分子物質(zhì)，脫脂乳、明膠、聚乙烯吡咯烷酮等，它們?cè)趦龈缮镏破分兄饕鸸羌茏饔?，使凍干制品形成多孔性、疏松的海綿狀物，從而使溶解度增加[8]；大分子明膠、聚乙烯吡咯烷酮具有很強(qiáng)的親水特性和氫鍵形成能力，利用其氫鍵和親水基形成一個(gè)穩(wěn)定的水分子層，阻礙膜內(nèi)結(jié)合水向外轉(zhuǎn)移，保護(hù)了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)[5]，谷氨酸鈉和高蛋白含量可顯著提升凍干過(guò)程細(xì)菌的存活率。小分子糖、醇的加入可提高干燥升華速度[7]，縮短凍干時(shí)間。但研究中發(fā)現(xiàn)過(guò)高濃度的小分子糖醇又會(huì)導(dǎo)致凍干制品表面起泡、不平整；過(guò)高濃度的PVP、PEG等高分子物質(zhì)，可顯著地延緩干燥過(guò)程，凍干制品的終含水量也較高。研究也表明，添加海藻糖可顯著提高凍干菌的耐熱性能，延長(zhǎng)保存期。Hubel[9]和Zayed[10]分別從“玻璃體學(xué)說(shuō)”和“水替代假說(shuō)”角度表明海藻糖分子能減少保存以及復(fù)水過(guò)程中細(xì)菌細(xì)胞的死亡，具有明顯的增強(qiáng)耐熱的功能。

表5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析

4 結(jié)束語(yǔ)

在保證外觀及良好復(fù)水性能的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)不同添加物的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，利用中心組合響應(yīng)曲面分析，通過(guò)凍干后活菌率、37℃（10 d）保存后的活菌率的評(píng)價(jià)，可獲得最佳的凍干保護(hù)劑配方為脫脂乳10%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)5%，海藻糖5%，維生素C為0.5%，此時(shí)凍干后活菌率的預(yù)測(cè)值可達(dá)到93.05%，37℃保存10 d后活菌率達(dá)77.26%。

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Study on freeze-drying protectant formula with heat-tolerance of complexLactic acid bacteria

SUN Ying,HUANG Jin-hai,LI Ying，JIA Cheng-kun,GAO Die,LIU Yang,LU Ke-cheng
(School of Chemical Engineering,Tianjin University,Tianjin 300072,China)

Aim:Effect of different additions was to be analysed and optimal freeze-drying protectant formula with heat-tolerance of comolexLactic Acid Bacteriastrains(LABs)was to be obtained.Method:Detection of bacterial livability,heat-tolerance,driage and oranoleptic indicator among five freeze-drying protectant formulas and different additives was performed.Then the central composite response surface was employed to obtain the multiple quadratic equations on bacterial livability,heat-tolerance and driage and significant analysis.Result:The protectant medium with good organoleptic property and redissolved compatibility was screened preliminarily.Furthermore,the optimal formula was obtained.Conclusion:The optimal cryoprotectant with 93.05%predicted livability and high heat-tolerance was obtained with 10%skimmed milk,5%polyvinylpyrrolidone(PVP),5%trehalose,and 0.5%Vitamin C.

lactic acid bacteria,freeze-drying protectant,central composite，heat-tolerance

Q939.11+7

A

1001-2230（2011）04-0012-04

2011-01-14

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（08JCZDJC22600）。

孫盈(1988-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

黃金海