張超壘，王成忠，張志國(guó),2,張玲梅

（1.山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,濟(jì)南 250353；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,南京 210095；3.山東龍大植物油有限公司，山東聊城 252000）

我國(guó)凝乳酶產(chǎn)生菌育種的研究進(jìn)展

張超壘1，王成忠1，張志國(guó)1,2,張玲梅3

（1.山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,濟(jì)南 250353；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,南京 210095；3.山東龍大植物油有限公司，山東聊城 252000）

綜述了目前我國(guó)在凝乳酶產(chǎn)生菌在自然選育、誘變育種和基因工程育種這3方面的研究進(jìn)展情況。

微生物凝乳酶；自然選育；誘變育種；基因工程育種

0 引言

隨著人們生活水平的提高及生活觀念的轉(zhuǎn)變，奶酪生產(chǎn)行業(yè)得到了很快的發(fā)展，與之相關(guān)的凝乳酶生產(chǎn)行業(yè)也發(fā)生了很大的變化：到目前為止，在酶制劑行業(yè)，凝乳酶已躍居成為世界第二酶制劑[1]；生產(chǎn)凝乳酶的方法也從小牛皺胃提取法發(fā)展到了植物組織提取法和微生物發(fā)酵生產(chǎn)法。利用微生物生產(chǎn)凝乳酶，發(fā)酵周期短、產(chǎn)量大及成本較低，在酶制劑生產(chǎn)行業(yè)得到廣泛認(rèn)同，與此同時(shí)凝乳酶產(chǎn)生菌育種的研究也日漸興起。

1 凝乳酶簡(jiǎn)介

1.1 凝乳酶及其分類(lèi)

凝乳酶是一種能使牛乳凝固的酶。傳統(tǒng)意義上的凝乳酶是小牛皺胃酶，它以前體的形式合成，經(jīng)過(guò)剪切形成具有323個(gè)氨基酸殘基的活性凝乳酶分子，等電點(diǎn)為4.2，分子量為40 500 u。小牛皺胃酶，具有酸性蛋白酶家族的類(lèi)二折疊對(duì)稱(chēng)的特點(diǎn)，分子可分為由1～175氨基酸殘基組成的N端區(qū)域和由176～323氨基酸殘基組成的C端區(qū)域，在N端區(qū)域和C端區(qū)域的分離裂溝底部發(fā)現(xiàn)兩個(gè)天冬氨基酸活性位點(diǎn)，Asp-34和Asp-216。凝乳酶分子中，氨基酸殘基和水分子在活性位點(diǎn)形成廣泛的氫鍵網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以維持凝乳酶的類(lèi)二折疊對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)；二硫鍵Cys-250和Cys-283，對(duì)酶的活性有重要影響[2]。

根據(jù)凝乳酶的來(lái)源，可把凝乳酶分為動(dòng)物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶。動(dòng)物凝乳酶，可從牛、豬和羊的胃中獲?。簞⑽淖诘萚3]發(fā)現(xiàn)乳豬胃酶具有凝乳性；張富新等[4]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)羔羊皺胃酶也有較低的凝乳性。許多植物蛋白酶能使牛乳凝固，張富新等[4]利用木瓜蛋白酶和無(wú)花果蛋白酶與小牛皺胃酶和羔羊皺胃酶制得了較理想的干酪；紀(jì)麗蓮等[5]發(fā)現(xiàn)牛乳中添加5%生姜蛋白酶粗提物，60℃保溫4 min可使牛乳凝固；張寒冰等[6]用姜汁和胃蛋白酶混合制作了各項(xiàng)指標(biāo)都較好的干酪。微生物凝乳酶的研究始于自20世紀(jì)50年代末,主要在美國(guó)、日本、西德、丹麥等國(guó)進(jìn)行，所用菌種主要有栗疫菌、毛霉、微小毛霉和蠟狀芽胞桿菌等[7]；自1964年Arima發(fā)現(xiàn)Mucor pusillus可產(chǎn)生高活力凝乳酶以來(lái)，已有許多科學(xué)家發(fā)現(xiàn)產(chǎn)凝乳酶的新菌種，到目前為止，發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)凝乳酶微生物達(dá)40余種[8]。

1.2 凝乳酶的凝乳機(jī)制

牛乳在凝乳酶作用下凝固，是由酪蛋白變化而引起的。牛乳中酪蛋白可分為αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。在酪蛋白膠體中，它們對(duì)于Ca2+的敏感程度不同，αs-酪蛋白易受Ca2+的影響而沉淀；在室溫以上并有Ca2+存在時(shí)，β-酪蛋白也形成沉淀；而κ-酪蛋白不僅本身穩(wěn)定，且還具有抑制αs-酪蛋白及β-酪蛋白在Ca2+影響下沉淀的保護(hù)作用。牛乳中酪蛋白酸鈣-磷酸鈣復(fù)合體膠粒能保持相對(duì)穩(wěn)定的膠體懸浮液狀態(tài)是與κ-酪蛋白的膠體保護(hù)作用是密切相關(guān)的。凝乳酶的凝乳過(guò)程可分為兩步：第一步，凝乳酶專(zhuān)一性水解乳中κ-酪蛋白的敏感鍵Phe105-Met106鍵，使其生成副κ-酪蛋白和糖巨肽；第二步，當(dāng)總κ-酪蛋白被水解掉約85%時(shí)，生成的副κ-酪蛋白在Ca2+的存在下引起凝固，而對(duì)Ca2+穩(wěn)定性差的αs-酪蛋白及β-酪蛋白，喪失了酪蛋白的膠體保護(hù)作用，隨副κ-酪蛋白聚集，形成凝膠體系。凝膠形成網(wǎng)絡(luò)，凝膠中的水分通過(guò)脫水收縮排出[7]。

2 微生物育種的方法

微生物育種，指培育優(yōu)良微生物的生物技術(shù)，它是提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的一條有效途徑，通?？煞譃樽匀贿x育和人工育種兩大類(lèi)。

2.1 自然選育

自然選育是指對(duì)自然界中的微生物，在未經(jīng)人工誘變或雜交處理的情況下進(jìn)行分離和純化，然后進(jìn)行純培養(yǎng)和測(cè)定，選擇優(yōu)良的菌株進(jìn)行保藏。自然選育簡(jiǎn)單易行，可達(dá)到純化菌種，防止菌種退化，提高產(chǎn)量的目的，但在自然條件下基因發(fā)生突變的幾率特別低，所以選育效果不是很理想[9]。自然選育沿用多年，至今仍是工業(yè)微生物育種的手段之一。

2.2 人工育種

誘變育種是利用物理或化學(xué)因素處理均勻分布的微生物細(xì)胞群，在促進(jìn)其突變率顯著提高的基礎(chǔ)上，采用簡(jiǎn)便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合目的的突變株，以獲得供科學(xué)實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)踐使用的理想突變菌株[10]，它是發(fā)酵工業(yè)中的提供優(yōu)良高產(chǎn)菌株的經(jīng)典方法。代謝控制育種是在誘變育種的基礎(chǔ)上，獲得各種解除或繞過(guò)了微生物正常代謝的突變株，人為地使有用產(chǎn)物選擇性地大量生成累計(jì)，并且在有控制的條件下培養(yǎng)，大量地生產(chǎn)這種有用產(chǎn)物[11]，它打破了微生物調(diào)節(jié)的控制機(jī)制，將有用的代謝產(chǎn)物得到大量積累。雜交育種是在誘變育種基礎(chǔ)上利用兩個(gè)或多個(gè)遺傳性狀差異較大的菌株，通過(guò)有性雜交、準(zhǔn)性雜交、原生質(zhì)體融合和遺傳轉(zhuǎn)化等方式，而導(dǎo)致其菌株間的基因的重組，把親代的優(yōu)良性狀集中在后代中的一種育種技術(shù)[9]?；蚬こ逃N是在基因水平上，運(yùn)用人為方法將所需供體生物的某一遺傳物質(zhì)提取出來(lái)，離體條件下用適當(dāng)工具酶進(jìn)行切割后，與載體連接,然后導(dǎo)入另一細(xì)胞，使外源遺傳物質(zhì)在受體細(xì)胞中進(jìn)行正常復(fù)制和表達(dá)，是當(dāng)前最先進(jìn)的育種技術(shù)[12]。

3 我國(guó)凝乳酶產(chǎn)生菌的育種

3.1 自然選育

自然選育凝乳酶產(chǎn)生菌，運(yùn)用常規(guī)純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)自然條件下的微生物進(jìn)行分離純化，再進(jìn)行篩選得到產(chǎn)凝乳酶的優(yōu)良菌種。雖然自然條件下基因發(fā)生突變的幾率很低，選育優(yōu)良菌株的可能性不大，我國(guó)學(xué)者仍然在此方面做了很多有益的嘗試。郭光遠(yuǎn)等[13]在對(duì)云南不同地區(qū)的湖泊采集土樣、湖底泥和水樣，進(jìn)行分離純化，得到2502株放線(xiàn)菌、真菌、細(xì)菌進(jìn)行了凝乳酶產(chǎn)生菌的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)放線(xiàn)菌中鏈霉菌屬（Streptomyces）、小單胞菌屬（Micromonospora）、馬杜拉放線(xiàn)菌屬（Actinomadura）等和9.8%的真菌及8.8%的細(xì)菌中都有一定的凝乳酶酶活力。劉振民等[14]從酒藥中篩選出一株凝乳酶高產(chǎn)菌株,并對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)酶條件研究,結(jié)果表明:土豆汁培養(yǎng)基是適宜產(chǎn)凝乳酶培養(yǎng)基,培養(yǎng)基起始pH值為6.43～6.51,培養(yǎng)時(shí)間為59～64 h,培養(yǎng)溫度為34～35℃,該菌株的凝乳酶活可以達(dá)到80 SU/mL。蔣詠梅等[15]從104份土樣中分離到一株產(chǎn)豆凝乳酶的芽孢桿菌(Bacillus sp.)。孫健等[16]從17株產(chǎn)凝乳酶的霉菌中初篩到產(chǎn)酶量較高的總狀毛霉(Mucorracemosus)菌株。李子木等[17]從14種酒曲中分離純化出了18株菌株,其中8個(gè)具有凝乳酶活力，采用酪蛋白平板法和Arima時(shí)間法篩選出了1株產(chǎn)生凝乳酶能力強(qiáng)的菌株。宋曦等[18]從天祝放牧牦牛生活環(huán)境土壤中分離出一株產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定，為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，其在麩皮培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h產(chǎn)凝乳酶活力高達(dá)89.56 SU/mL，蛋白水解力為21.27 U/mL。吳進(jìn)菊等[19]從中國(guó)曲中篩選出一株凝乳酶高產(chǎn)菌株Rhizopus arrhizus F34，研究得出該菌株產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：米粉麩皮水解液4.5%，黃豆粉水解液4.0%，CaCl20.3%，KCl 0.5%；最佳培養(yǎng)條件為：初始pH 4.5，培養(yǎng)60 h，此時(shí)凝乳酶活力可達(dá)161.14 SU/mL凝乳酶活力與蛋白酶活力比值為27.88。范素琴[20]從紅曲米中篩選出一株凝乳酶產(chǎn)生菌，研究顯示馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基是該菌最佳培養(yǎng)基,正交試驗(yàn)得出該菌最佳培養(yǎng)條件為：溫度30℃,轉(zhuǎn)速為160 r/min,振蕩培養(yǎng)72 h,此條件下凝乳酶活力可達(dá)150.6 SU/mL。

3.2 誘變育種

誘變育種，根據(jù)所用的誘變劑不同可分為物理誘變育種和化學(xué)誘變育種。常用的物理誘變劑為輻射中的各種射線(xiàn)，包括紫外線(xiàn)、X-射線(xiàn)、γ-射線(xiàn)、快中子、α-射線(xiàn)和宇宙線(xiàn)等；化學(xué)誘變劑是一類(lèi)能對(duì)DNA起作用、改變其結(jié)構(gòu)、并引起遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)，包括堿基類(lèi)似物、烷化劑、脫氨劑、金屬鹽類(lèi)及其他化學(xué)誘變劑[11]。誘變育種具有一定的盲目性，但仍是微生物育種最基礎(chǔ)的育種手段。對(duì)于凝乳酶產(chǎn)生菌的誘變育種，我國(guó)學(xué)者進(jìn)行了大膽的探索，獲得了具有應(yīng)用價(jià)值的優(yōu)良菌種。孫健等[16]以初篩得到的一株產(chǎn)酶量較高的總狀毛霉為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行了不同劑量60Co照射，篩選到一株變異菌株R132，凝乳活力提高了80%。郭光遠(yuǎn)等[13]選定一株毛霉(Mucor sp.)代號(hào)Y85-8512和一株芽孢桿菌(Bacillus sp.)代號(hào)Y85-8501作出發(fā)菌，經(jīng)誘變育種，得到凝乳活力分別可達(dá)到5 000 SU/g和10 000 S U/g的穩(wěn)定高產(chǎn)菌株。蔣詠梅等[15]以從土壤中篩選到的一株芽孢桿菌(Bacillus sp.)為出發(fā)菌株，先進(jìn)行紫外照射，后經(jīng)硫酸二已酯處理，誘變獲得一株凝乳酶高產(chǎn)菌株，對(duì)其優(yōu)化培養(yǎng)基組成成分，凝乳酶活力提高5倍以上。邵淑娟等[21]對(duì)產(chǎn)凝乳酶的黑曲霉進(jìn)行微波輻照，酪蛋白培養(yǎng)基凝乳圈初篩，基礎(chǔ)培養(yǎng)基固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩，誘變選育出遺傳穩(wěn)定的突變株WB6-3、WB2-5，凝乳活力分別比出發(fā)菌株提高了35%和14%。

3.3 基因工程育種

基因工程育種往往是先得到目的基因，然后選擇載體，準(zhǔn)備載體并與目的基因連接成重組DNA，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，最后是利用遺傳標(biāo)記和分子生物方法等篩選具有表達(dá)目的基因功能的重組體，從而構(gòu)建具有特殊功能的基因工程菌。基因工程育種則實(shí)現(xiàn)了微生物選育的理性化，人們運(yùn)用此手段可以定向地孕育新的微生物菌種。在基因工程育種凝乳酶產(chǎn)生菌方面,我國(guó)在對(duì)表達(dá)載體以及啟動(dòng)子的篩選方面做了研究[22]。王志林等[23]通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性的引物,采用RT-PCR方法從未成熟的木瓜組織中擴(kuò)增得到木瓜凝乳酶基因,并將其重組到pPIC9K載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌并篩選陽(yáng)性克隆,選育出了攜帶木瓜凝乳酶基因大腸桿菌。張渝英等[24]應(yīng)用含有tac啟動(dòng)子和牛凝乳酶B基因的表達(dá)質(zhì)粒pTaAC進(jìn)行了構(gòu)建，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM105中，凝乳酶原基因的表達(dá)受溫度和加入的IPTG誘導(dǎo)劑所調(diào)控，活性酶產(chǎn)量達(dá)到14～20 mg/L。王革等[25]研究表明核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）的二級(jí)結(jié)構(gòu)在原核生物中是決定翻譯起始的一個(gè)關(guān)鍵因素,為了避免使用價(jià)格昂貴的誘導(dǎo)劑IPTG及進(jìn)一步提高牛凝乳酶原基因表達(dá)水平,采用PRPL啟動(dòng)子取代Tac啟動(dòng)子，構(gòu)建一套帶有trp啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)變異翻譯起始區(qū)段，可使大腸桿菌表達(dá)凝乳酶達(dá)到總細(xì)胞蛋白的39%。張莉等[26]從小牛皺胃中提取凝乳酶(Chymosin)總RNA,經(jīng)過(guò)RT-PCR獲得凝乳酶cDNA,純化后與pMD-18T載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,通過(guò)雙酶切和序列測(cè)定,獲得了凝乳酶全長(zhǎng)基因序列，將其克隆到原核表達(dá)載體pET-22b中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b/Chymosin，為凝乳酶的進(jìn)一步表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。孫大慶等[27]從克隆載體pS19-PPC中獲得牛凝乳酶原基因,將該基因與表達(dá)載體pNZ8148連接，轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ9000,轉(zhuǎn)化子經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定后,用nisin進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物純化后檢測(cè)，其凝乳活性可達(dá)2×103mL-1（國(guó)際凝乳酶活數(shù)）。姜媛媛等[28]將克隆到微小毛霉凝乳酶基因，插入原核表達(dá)載體pTWlN1中，使之與幾丁質(zhì)結(jié)合域(CBD)一內(nèi)含肽(intein)融合，獲得原核表達(dá)質(zhì)粒pTWIN1/M，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得了重組蛋白。

4 展望

隨著經(jīng)濟(jì)全球化進(jìn)程的加速，奶酪的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到了人們的認(rèn)同，在奶酪制造工藝成熟和其潛在消費(fèi)市場(chǎng)巨大的前提下，我們需要優(yōu)良凝乳酶產(chǎn)生菌用于凝乳酶制劑的生產(chǎn)。在選育凝乳酶產(chǎn)生菌方面，我們要做好以下工作：（1）篩選更多的優(yōu)良菌種來(lái)生產(chǎn)凝乳酶；（2）利用傳統(tǒng)誘變選育凝乳酶高產(chǎn)菌株，用于凝乳酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)；（3）獲得非正常代謝的突變株，人為使凝乳酶選擇性地大量生成累積，并且在有控制的條件下培養(yǎng)，大量地生產(chǎn)凝乳酶；（4）在誘變育種基礎(chǔ)上利用兩個(gè)或多個(gè)遺傳性狀差異較大的菌株，通過(guò)有性雜交、準(zhǔn)性雜交、原生質(zhì)體融合和遺傳轉(zhuǎn)化等方式，把親代的優(yōu)良性狀集中在產(chǎn)凝乳酶菌株上；（5）尋找更好的載體、宿主細(xì)胞和啟動(dòng)子，不斷提高凝乳酶在受體細(xì)胞中的表達(dá)率效率。相信伴隨著微生物育種技術(shù)的進(jìn)步和凝乳酶需求量的劇增，凝乳酶產(chǎn)生菌的育種會(huì)在我國(guó)得到很好的發(fā)展。

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Rearch advancement of the strain breeding which can produce chymosin in China

ZHANG Chao-lei1，WANG Cheng-zhong1，ZHANG Zhi-guo1,2，ZHANG Ling-mei3
(1.College of Food Engineering and Biotechnology,Shandong Institute of Light Industry,Jinan 250353,China;2.College of Food Science and technology，Nanjing Aragricultural University,Nanjing 210095,China;Shandong LongDa Plant Oil Co.,Ltd.,Liaocheng 252000，China)

.In terms of natural screening,mutation breeding and the breeding of gene engineering,this paper reviewed the rearch advancement of the strain breeding which can produce chymosin in China.

microbial chymosin；natural screening；mutation breeding；the breeding of gene engineering

Q935

B

1001-2230（2011）04-0036-03

2010-09-29

張超壘（1983-），男，碩士研究生,研究方向?yàn)槭称焚Y源開(kāi)發(fā)。

王成忠