武陽，馬文麗，王蘭

（山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006）

華溪蟹主要組織蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系的建立

武陽，馬文麗，王蘭*

（山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006）

為深入研究重金屬脅迫下華溪蟹主要組織蛋白質(zhì)的差異表達，對華溪蟹心臟及鰓總蛋白質(zhì)的雙向電泳技術(shù)體系進行了初步探討.通過對樣品處理方法、上樣量大小以及雙向電泳實驗條件的比較選擇，初步建立了適用于華溪蟹組織蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)體系.結(jié)果表明：選取p H 3～10的24 cmIPG膠條，上樣量1.0 mg，得到了較為理想的華溪蟹心臟及鰓雙向電泳圖譜；分離到的心臟蛋白質(zhì)多集中于p H 5.5～9，而鰓蛋白質(zhì)多集中于p H 4～7.

蛋白質(zhì)組；華溪蟹；雙向電泳；心臟；鰓

蟹類是低等指示生物在水體環(huán)境中代表性的物種，生活于水體基底層，直接面對沉積于水體中的金屬離子，適于作為檢測水體重金屬污染的指示生物［1］.河南華溪蟹（Sinopotamon henanense）是我國特有的淡水蟹種類，分布廣泛，易采易養(yǎng)，是一種較好的模式生物.

進入后基因組時代，蛋白質(zhì)組學的研究成為生命科學領(lǐng)域關(guān)注的熱點［2］.利用蛋白質(zhì)組學可以大規(guī)模研究一種組織乃至生物的蛋白質(zhì)特征，研究蛋白質(zhì)的翻譯、修飾、表達機理及蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用［3］，而它的發(fā)展卻受到技術(shù)條件的限制，在實際研究過程中，蛋白質(zhì)組學的研究技術(shù)難于基因組學的研究技術(shù)，需要通過大量實驗來摸索.

雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學研究中最為基本和重要的技術(shù)［4-5］.GE Healthcare公司的 Multiphor II雙向電泳系統(tǒng)是目前使用最廣泛、發(fā)展最成熟的蛋白質(zhì)組學研究平臺.本實驗采用此套雙向電泳系統(tǒng)，對華溪蟹心臟及鰓組織的蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)進行了摸索，初步建立了適用于華溪蟹組織蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)體系，為華溪蟹不同組織蛋白質(zhì)組學的進一步研究奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

河南華溪蟹購自太原市五龍口水產(chǎn)市場，置實驗室水族缸（130 cm×50 cm×60 cm）中暫養(yǎng)兩周后進行實驗.暫養(yǎng)期間每隔2 d喂食1次.實驗時用鑷子將溪蟹從缸中取出，用去離子水沖洗干凈，電子天平稱重后在解剖盤中解剖，小心取出心臟及鰓等組織備用.

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

Multiphor II雙向電泳系統(tǒng)，包括Ettan IPGphor 3等電聚焦系統(tǒng)、Ettan DALT six大規(guī)模垂直電泳系統(tǒng)及Image Scanner掃描儀（GE Healthcare）；臺式冷凍高速離心機（德國Eppendorf）.

1.2.2 主要試劑

24 cm、p H 3～10 IPG預(yù)制膠條、礦物油、Pharmalyte p H 3～10載體兩性電解質(zhì)、CHAPS、二硫蘇糖醇（DTT）、尿素、硫脲、碘乙酰胺均購自GE公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS、低熔點瓊脂糖購自Sigma公司；硝酸銀、甲醇、甲醛、碳酸鈉、過硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、蔗糖、甘油、甘氨酸、溴酚藍為國產(chǎn)分析純試劑；牛血清白蛋白（BSA）為國產(chǎn)生物技術(shù)純試劑.

1.2.3 主要溶液

裂解液：4.985 g尿素，1.52 g硫脲，0.1 g DTT（臨用加入），0.2 g CHAPS，200μL IPG buffer（3-10），加入超純水至總體積10 m L.

水化液：8.41 g尿素，3.04 g硫脲，0.046 g DTT（臨用加入），0.4 g CHAPS，100μL IPG buffer（3-10），加入超純水至總體積20 m L.

平衡緩沖液：72 g尿素，47.54 m L甘油，4 gSDS，6.68 m L分離膠緩沖液，0.004 g溴酚藍，加入超純水至總體積200 m L.

平衡液Ⅰ：使用前每10 m L平衡緩沖液中加入100 mgDTT（臨用時配制）.平衡液Ⅱ：使用前每10 m L平衡緩沖液加入400 mg碘乙酰胺（臨用時配制）.

1.3 方法

1.3.1 樣品制備與蛋白定量

取新鮮組織（心臟、鰓）1 g，加入5 m L裂解液，勻漿器勻漿，4℃，12 000 r／min離心20 min.取上清液，加入2倍體積的丙酮（內(nèi)含0.07%（V／V）的β-巰基乙醇，-20℃預(yù)冷），放置30 min，4℃，15 000 r／min離心20 min.棄上清，用-20℃預(yù)冷丙酮洗滌沉淀，室溫干燥，最后用水化液1 m L溶解沉淀，4℃，12 000 r／min離心20 min，上清液即為樣品溶液.操作過程中應(yīng)盡量保持低溫，以防止蛋白質(zhì)降解.取部分樣品，用Bradford法測定蛋白濃度.

1.3.2 水化上樣與第一向等電聚焦電泳

實驗采用24 cm的IPG膠條.在膠條槽中加入水化液450μL，按總蛋白量1.0 mg加入樣品溶液，加入適量溴酚藍染液.取出膠條從酸性端（標“＋”端）剝?nèi)PG保護膜，膠面朝下，將膠條陽極放入膠條槽對應(yīng)位置，使其接觸水化液，繼續(xù)放下膠條，使水化液全部浸潤整個膠條并保證膠條的兩端與槽兩端的電極接觸良好.放好膠條后，用膠頭滴管覆蓋足量的覆蓋油.蓋好膠條蓋，放入Ettan IPGphor 3中進行第一向等電聚焦電泳.第一向的等電聚焦條件：（1）60 V，10 h（2）200 V，2 h（3）500 V，1 h（4）1 000 V，2 h（5）5 000 V，1 h（6）10 000 V，3 h（7）10 000 V，55 000 Vh（8）1 000 V，10 h.膠條限流為：50μA／條，電泳大約24 h.

1.3.3 IPG 膠條的平衡

第一向電泳完成后，用鑷子取出膠條放入塑料管中進行平衡.倒入適量平衡液Ⅰ（漫過膠面一些距離即可），放在脫色搖床上振蕩15 min.倒掉平衡緩沖液I，加入適量平衡緩沖液II，繼續(xù)振蕩15 min，取出膠條，做下一步使用.

第一步平衡在平衡液中加入DTT，是為了使變性的非烷基化的蛋白質(zhì)處于還原狀態(tài)；第二步平衡中加入碘乙酰胺，是為了使蛋白質(zhì)巰烷基化，防止它們在電泳過程中重新氧化，碘乙酰胺還能使殘留的DTT烷基化.

1.3.4 第二向SDS-PAGE電泳

配制10%的均一分離膠，在Ettan DALT six垂直電泳系統(tǒng)中灌膠并加水覆蓋，將平衡后的IPG膠條在電泳緩沖液中潤濕后，直接轉(zhuǎn)移至分離膠頂端.膠條支持膜一側(cè)貼玻璃面，排出膠條與玻璃面之間的氣泡.用0.15%瓊脂糖封閉凝膠.電泳槽中灌注電泳緩沖液，4℃電泳.電泳參數(shù)為80 V，1 h；240 V，4 h.當溴酚藍指示劑遷移到凝膠底部時結(jié)束電泳.

1.3.5 染色

采用銀染法對凝膠進行染色.按照GE儀器操作手冊中銀染法配制固定液、敏化液、銀染液、顯色液、終止液，染色步驟同樣按操作手冊進行.

1.3.6 凝膠掃描及分析

用Image Scanner掃描儀對染色后的凝膠進行掃描，并利用Image Master 2D Platinum 6.0軟件對圖像進行處理和分析.

2 結(jié)果與分析

通過對樣品處理方法、上樣量大小以及雙向電泳實驗條件的摸索，選取p H 3～10的24 cm IPG膠條，上樣量1.0 mg（以總蛋白量計），得到了較為理想的華溪蟹心臟雙向電泳圖譜（圖1）.分離出的心臟蛋白質(zhì)斑點數(shù)量豐富，邊界清晰，大部分蛋白點集中于p H 5.5～9，在酸性端檢測到的蛋白質(zhì)較少.電泳圖譜基本上沒有縱向拖尾，但呈現(xiàn)輕微的橫向紋理，應(yīng)該是第一向聚焦不完全所致，還需在等電聚焦實驗流程方面進一步優(yōu)化改進.

圖2為獲得的華溪蟹鰓蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜.結(jié)果顯示，與心臟蛋白質(zhì)分布范圍明顯不同，分離到的華溪蟹鰓蛋白質(zhì)多集中在p H 4～7，堿性端檢測到的很少.在p H 5～7內(nèi)的蛋白質(zhì)斑點邊界清晰，沒有橫紋與拖尾，而在偏酸性端p H 4～5范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)分布十分緊密，有明顯的縱向拖尾現(xiàn)象，還需在蛋白質(zhì)樣品的提取及處理方面繼續(xù)摸索優(yōu)化.

圖1 華溪蟹心臟蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜Fig.1 2DE-PAGE patterns of proteins extracted from heart of S.henanense

圖2 華溪蟹鰓蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜Fig.2 2DE-PAGE patterns of proteins extracted from gill of S.henanense

3 討論

3.1 上樣量的選擇

上樣量在雙向電泳中起著相當關(guān)鍵的作用，它的大小取決于膠條的長度、p H范圍以及染色方法等.使用較大上樣量會使產(chǎn)生的蛋白斑點不易分離，點顯得雜亂；而上樣量太小，會遺失很多低豐度蛋白，從而使電泳圖像中的點很少［6］.要得到一個比較好的結(jié)果，需要在實驗中不斷摸索，找到最適合的上樣量.

實驗中對上樣量進行了摸索.第一次使用了GE手冊推薦的上樣量200μg總蛋白進行了實驗，銀染后發(fā)現(xiàn)在圖譜上按預(yù)期出現(xiàn)了一些較清晰的點，但出現(xiàn)的點很少，達不到蛋白質(zhì)組的要求.因此，又使用更大的上樣量1 mg總蛋白，獲得了較為理想的蛋白質(zhì)斑點豐富清晰的華溪蟹心臟蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜.而鰓因成分更復雜，在偏酸性的p H 4～5內(nèi)，電泳圖譜不盡理想，還需進一步改進樣品處理方法及摸索更適合的上樣量.因此我們認為對于銀染法而言，GE儀器手冊推薦的200μg的上樣量是偏低的，應(yīng)該在600μg～1 mg.

3.2 樣品處理

樣品處理是雙向電泳的關(guān)鍵步驟，它直接關(guān)系到雙向電泳的準確性和靈敏性.雙向電泳對實驗中樣品蛋白質(zhì)純度的要求相當高.因此選擇一種較先進的方法對樣品進行提純處理，得到除蛋白質(zhì)外基本不含其他物質(zhì)的樣品，是決定雙向電泳是否成功的很關(guān)鍵的一步［7］.

本實驗我們采用了一種較常規(guī)的方式進行樣品處理.首先采用玻璃勻漿器對組織進行了勻漿破碎，然后用冰丙酮對蛋白質(zhì)進行了多次沉淀洗滌.結(jié)果顯示，這種處理方法對心臟十分適宜，獲得了斑點豐富清晰的華溪蟹心臟蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜.而對于鰓而言，因富含酸性蛋白質(zhì)，還需進一步優(yōu)化樣品處理方法.

3.3 等電聚焦程序

合理的等電聚焦程序也是獲得高分辨率圖譜的基礎(chǔ)，對凝膠圖譜上的橫紋有直接的影響［8］.我們選擇了GE儀器手冊推薦的常規(guī)程序：（1）60 V，10 h（2）200 V，2 h（3）500 V，1 h（4）1 000 V，2 h（5）5 000 V，1 h（6）10 000 V，3 h（7）10 000 V，55 000 Vh（8）1 000 V，10 h，結(jié)果在24 h內(nèi)順利達到電流為0的聚焦效果.但我們觀察到，在整個聚焦電泳過程中，電泳電壓并未完全按照我們所設(shè)定的步驟工作，電壓的走勢是線性的，有利于達到更好的電泳效果.實驗結(jié)果顯示，華溪蟹心臟蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜有輕微的橫紋現(xiàn)象，可以通過適當延長除鹽時間來改善.

3.4 染色方法

目前雙向電泳主要使用銀染和考馬斯亮藍染色兩種方法.就分辨率而言，銀染是考染的100倍，靈敏度明顯優(yōu)于考染；銀染上樣量只需幾百微克，考染需要毫克級，但在操作上銀染復雜得多［9-10］.由于很高的靈敏度，整個染色過程要保證所有染色器皿、染色試劑絕對干凈，稍有不慎即會造成染色背景過深，影響電泳圖譜質(zhì)量.另外，銀染中顯色步驟也很關(guān)鍵，顯色時間不足會造成蛋白質(zhì)斑點丟失，而顯色過度會導致膠面變黑，圖譜背景過深，不易觀察.

3.5 雙向電泳中的試劑

雙向電泳因為靈敏度高，對試劑的要求特別高，要求達到優(yōu)級純.實驗過程中使用的水必須是超純水，所有溶液必須進行0.22微米微孔濾膜過濾［9-10］.由于實驗條件所限，銀染過程中一些試劑如硝酸銀、碳酸鈉、甲醛、甲醇我們使用了國產(chǎn)分析純藥品，對圖譜產(chǎn)生了背景過深的影響.

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Establishment of 2-DE Technique in Heart and Gill Proteome ofSinopotamonhenanense

WU Yang，MA Wen-li，WANG Lan
（SchoolofLifeScience，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China）

In order to research the differential expression of proteome in tissues of freshwater crabSinopotamonhenanenseinduced by heavy metals，the 2-DE（two-dimensional electrophoresis）related techniques for heart and gill proteome ofS.henanensewere studied.By comparative tests between different extraction methods，sample volume and isoelectric focusing programs，a tentative 2-DE method which suited for the separation of tissue proteome ofS.henanensewas established.The results showed that with 24 cm，p H 3～10 IPG strips and 1.0mg sample protein，relatively ideal 2-DE patterns in heart and gill proteome ofS.henanensewere successfully separated，heart proteins mainly distributed in the p H 5.5～9 range，whereas gill proteins mainly distributed in the p H 4～7 range.This study will set up the foundation for further research on proteomics ofS.henanense.

proteome；Sinopotamonhenanense；two-dimensional gel electrophoresis；heart；gills

Q-503

A

0253-2395（2011）S2-0108-04

2011-09-12

國家自然科學基金（30970361）；山西省自然科學基金（2010011043-2）

武陽（1986-），男，山西太原人，碩士研究生，主要研究華溪蟹金屬硫蛋白的表達及生物功能.E-mail：wus611＠gmail.com.*通訊作者，E-mail：lanwang＠sxu.edu.cn