陸國(guó)慶 ，鄭 江 ，鄭新川 ，魯永玲 ，何鳳慈

(1.中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)科研部，重慶 400038; 2.中國(guó)人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院臨床藥學(xué)科，四川 成都 610083; 3.中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038)

芘熒光探針?lè)ńY(jié)合曲線(xiàn)擬合研究膽鹽－磷脂混合納米膠束的聚集行為

陸國(guó)慶1，2，鄭 江3，鄭新川3，魯永玲3，何鳳慈1

(1.中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)科研部，重慶 400038; 2.中國(guó)人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院臨床藥學(xué)科，四川 成都 610083; 3.中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038)

目的研究不同磷脂比例的膽鹽－磷脂混合納米膠束的聚集行為。方法以芘為熒光探針，測(cè)定不同磷脂比例的膽鹽－磷脂混合納米膠束增溶芘后的熒光光譜，以 I1/I3值(I1=372 nm，I3=383 nm)為縱坐標(biāo)、膠束濃度對(duì)數(shù)值logC為橫坐標(biāo)，利用Origin8.0軟件進(jìn)行曲線(xiàn)擬合，以S型曲線(xiàn)的突變中點(diǎn)切線(xiàn)和平行切線(xiàn)的交點(diǎn)定義臨界膠束濃度。結(jié)果磷脂/膽鹽比例(W/W)為2∶1，1∶1，1∶2的混合膠束臨界膠束濃度分別為0.034，0.048，0.055 g/L。結(jié)論提高混合膠束中磷脂比例，可以減小膠束的臨界膠束濃度，有利于膠束發(fā)揮更大的增溶作用。

芘;熒光探針;膽鹽;磷脂;臨界膠束濃度

膽鹽－磷脂混合納米膠束(bile salt－phosphatidylcholine mixed nano－micelle，BS/PC－MM)是指在溶液中由溶質(zhì)分子(膽鹽、磷脂)通過(guò)締合方式形成的，以疏水基團(tuán)為內(nèi)核、親水基團(tuán)為外殼的分子有序聚集體，粒徑通常在10～100 nm范圍內(nèi)。兩親性溶質(zhì)分子在溶液中分散達(dá)到臨界膠束濃度(critical micelle concentration，CMC)時(shí)，分子即締合自組裝形成膠束。利用膠束對(duì)難溶性藥物進(jìn)行包裹，可顯著提高藥物溶解能力，還可增強(qiáng)藥物療效，減少輔料對(duì)機(jī)體的不良反應(yīng)，這是一種生物相容性藥物傳遞系統(tǒng)。國(guó)外學(xué)者已成功地將其應(yīng)用于地西泮類(lèi)藥物的增溶[1－3]。臨界膠束濃度可作為BS/PC－MM的一種度量，其值越小，表明形成膠束所需的濃度越低，越有利于形成膠束，越有利于對(duì)難溶性藥物的增溶。另外，臨床應(yīng)用時(shí)藥物進(jìn)入人體后，膠束制劑都會(huì)被液體進(jìn)一步稀釋?zhuān)♂尩揭欢ǔ潭葧r(shí)膠束將解締合，影響藥物形態(tài)的保持及其在體內(nèi)的釋放方式。因此研究不同種類(lèi)膠束的聚集行為，具有重要意義。芘熒光探針?lè)ú僮骱?jiǎn)單，對(duì)研究體系的干擾小，是一種研究膠束聚集行為的常規(guī)方法。芘熒光光譜中的 I1(372 nm)與 I3(383 nm)的比值I1/I3，強(qiáng)烈地依賴(lài)于芘本身所處體系的極性，可以利用 I1/I3值的變化來(lái)表征體系的極性變化，即利用 I1/I3對(duì)膠束濃度的對(duì)數(shù)值作曲線(xiàn)圖，找出其中 I1/I3變化的拐點(diǎn)，即為臨界膠束濃度[4－10]。本研究采用芘熒光探針?lè)ńY(jié)合Origin曲線(xiàn)擬合，研究不同磷脂比例混合納米膠束臨界膠束濃度的差異，討論了不同磷脂比例對(duì)膠束聚集行為的影響，以期為構(gòu)建增溶能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好的BS/PC－MM提供有益的參考。

1 儀器與試藥

F 2500型熒光分光光度計(jì)(日本日立公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Büchi公司):V－800型蒸發(fā)器，V－500型真空裝置，B－490型水浴裝置，B－740型冷凝器;艾科普ACD－6000－U型高端超純水系統(tǒng);5417R型低溫高速離心機(jī)(Eppendorf);電子天平(Sartorius，BS223S，max 220 g，d=0.001 g;Sartorius BP61S，max 61 g，d=0.1 mg);KQ －50B型超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。冬凌草甲素(oridonin，ORI，純度大于98.07%，西安旭煌生物科技有限公司，批號(hào)為 081216);大豆磷脂(soya phosphatidylcholine，SPC，純度大于90%，上海太偉藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20080320);脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate，SDC，純度大于90%，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，批號(hào)為20090114);芘(純度99.0%，Sigma公司);水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 芘儲(chǔ)備液配置

精密稱(chēng)量芘37.9mg，以10mL丙酮溶解，超聲至澄清，取0.5mL，置10 mL容量瓶中，丙酮定容，取0.4 mL，置10 mL容量瓶，丙酮定容，分別吸取0.1 mL，置10 mL容量瓶中，揮干丙酮，加入10 mL膠束溶液，即可得濃度為4×10－7mol/L的芘儲(chǔ)備液。

2.2 混合膠束制備

精密稱(chēng)量處方量大豆磷脂、脫氧膽酸鈉(固定總濃度，大豆磷脂與脫氧膽酸鹽之比為2∶1，1∶1，1∶2)，制備混合膠束，分別加入各容量瓶中，最后加入超純水定容，使膠束溶液質(zhì)量濃度分別為1 ×10－4，3 × 10－4，6 × 10－4，1 × 10－3，2 ×10－3，6 ×10－3，1 × 10－2，3 ×10－2，6 ×10－2，1 × 10－1，3 ×10－1g/L。

2.3 熒光發(fā)射光譜測(cè)定

將膠束溶液加至各容量瓶中(使芘溶液濃度為4×10－7mol/L)，超聲30 min，室溫放置24 h，測(cè)定各稀釋液的熒光發(fā)射光譜，計(jì)算 I1/I3值。

激發(fā)光波長(zhǎng)確認(rèn)[4－5]:使芘溶液濃度為4×10－7mol/L，固定發(fā)射波長(zhǎng)350 nm，Ex狹縫為5 nm，Em狹縫為2.5 nm，激發(fā)電壓700 mV，掃描速度300 nm/min，激發(fā)波長(zhǎng)掃描范圍220～500 nm。確認(rèn)激發(fā)波長(zhǎng)為336 nm，與文獻(xiàn)[4－5]報(bào)道的一致。見(jiàn)圖1。

熒光光譜突變點(diǎn) I1及 I3確認(rèn)[4－5]:使芘溶液濃度為4×10－7mol/L，膠束溶液質(zhì)量濃度分別為 1 ×10－4，3 ×10－4，6 ×10－4，1 ×10－3，2×10－3，6 ×10－3，1 ×10－2，3 ×10－2，6 ×10－2，0.1，0.3 g/L。激發(fā)波長(zhǎng)為336 nm，Ex狹縫為5 nm，Em狹縫為2.5 nm，激發(fā)電壓為700 mV，掃描速度為300 nm/min，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍 350～450 nm。結(jié)果芘熒光發(fā)射光譜共5個(gè)突變點(diǎn)，其中 I1(372nm)及 I3(383 nm)是試驗(yàn)所需要的突變點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

2.4 不同磷脂比例混合膠束芘熒光探針光譜的I1/I3計(jì)算

按照大豆磷脂與脫氧膽酸鹽之比(SPC/SDC)為 2 ∶1，1 ∶1，1 ∶2(W/W)，分別計(jì)算在不同濃度組的 I1/I3值。結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 芘熒光激發(fā)波長(zhǎng)確認(rèn)

圖2 不同濃度混合膠束溶液中芘的熒光發(fā)射光譜

表1 不同磷脂比例、不同濃度混合膠束中的芘熒光探針光譜的 I1/I3值(n=3，±s)

表1 不同磷脂比例、不同濃度混合膠束中的芘熒光探針光譜的 I1/I3值(n=3，±s)

C(g/L) log C SPC/SDC=1 ∶2 SPC/SDC=1∶1 SPC/SDC=2∶1 123123123 0.000 1 0.000 3 0.000 6 0.001 0.002 0.006 0.01 0.03 0.06 0.1 0.3 0.6 1－4.00－3.52－3.22－3.00－2.70－2.22－2.00－1.52－1.22－1.00－0.52－0.22 0.00 1.785 1.789 1.760 1.762 1.700 1.629 1.482 1.289 1.197 1.194 1.193 1.168 1.161 1.781 1.770 1.776 1.760 1.721 1.614 1.511 1.266 1.217 1.218 1.167 1.152 1.144 1.779 1.769 1.762 1.749 1.737 1.621 1.523 1.351 1.234 1.214 1.160 1.153 1.144 Mean 1.781 1.776 1.766 1.757 1.719 1.621 1.505 1.302 1.216 1.209 1.173 1.158 1.149 SD 0.002 0.009 0.007 0.006 0.015 0.006 0.017 0.036 0.015 0.011 0.014 0.007 0.008 1.750 1.742 1.745 1.704 1.706 1.612 1.496 1.272 1.193 1.152 1.145 1.145 1.147 1.752 1.748 1.742 1.703 1.713 1.590 1.495 1.259 1.197 1.148 1.142 1.144 1.142 1.757 1.754 1.725 1.700 1.678 1.573 1.479 1.267 1.198 1.158 1.141 1.151 1.143 Mean 1.753 1.748 1.737 1.702 1.699 1.591 1.490 1.266 1.196 1.152 1.143 1.147 1.144 SD 0.003 0.005 0.009 0.001 0.015 0.016 0.008 0.006 0.002 0.004 0.002 0.003 0.002 1.768 1.739 1.746 1.736 1.716 1.559 1.429 1.243 1.178 1.157 1.162 1.155 1.159 1.769 1.749 1.748 1.718 1.686 1.552 1.432 1.257 1.185 1.156 1.155 1.153 1.158 1.768 1.759 1.748 1.732 1.696 1.548 1.410 1.238 1.178 1.158 1.161 1.156 1.151 Mean 1.768 1.749 1.747 1.728 1.699 1.553 1.424 1.246 1.180 1.157 1.159 1.155 1.156 SD 0.000 0.008 0.001 0.008 0.012 0.005 0.010 0.008 0.003 0.001 0.003 0.001 0.004

2.5 曲線(xiàn)擬合

以芘的熒光光譜強(qiáng)度 I1/I3為縱坐標(biāo)、混合膠束溶液濃度對(duì)數(shù)值logC為橫坐標(biāo)，采用Origin8.0軟件擬合曲線(xiàn)。因曲線(xiàn)變化趨勢(shì)符合Boltzmann 公式[4－10]:I1/I3=A2+(A1－ A2)/{1+exp[(X － x0)/dx]}，其中 A1是低濃度下的 I1/I3，A2是高濃度下的 I1/I3，X0是曲線(xiàn)突變的中點(diǎn)。結(jié)果采用Origin8.0軟件進(jìn)行曲線(xiàn)擬合，得到突變中點(diǎn) X0，經(jīng)與Matlab軟件對(duì)數(shù)據(jù)二次求導(dǎo)所獲拐點(diǎn)，數(shù)據(jù)一致。見(jiàn)圖3。

圖3 不同磷脂比例、不同濃度混合膠束中芘熒光探針光譜的I1/I3與濃度對(duì)數(shù)值的曲線(xiàn)擬合

2.6 臨界膠束濃度確定

因膽鹽和磷脂屬于低相對(duì)分子質(zhì)量表面活性劑，結(jié)合文獻(xiàn)[5]方法，不能單純依靠 X0值對(duì)臨界膠束濃度進(jìn)行判斷，否則容易產(chǎn)生誤差。故需要在確定突變中點(diǎn)的情況下，繪制曲線(xiàn)切線(xiàn)，通過(guò)傾斜部分與水平部分的切線(xiàn)交點(diǎn)，確定膠束的臨界膠束濃度。根據(jù)切線(xiàn)交點(diǎn)的橫坐標(biāo)值進(jìn)行對(duì)數(shù)求值，可得不同大豆磷脂與脫氧膽酸鹽之比(SPC/SDC)的混合膠束的臨界膠束濃度。結(jié)果見(jiàn)圖4及表2?？梢?jiàn)，提高混合膠束中磷脂比例，可以減小混合膠束的臨界膠束濃度。

表2 不同磷脂比例混合膠束的臨界膠束濃度

圖4 不同磷脂比例混合膠束的臨界膠束濃度(SPC/SDC=1∶2(W/W))

3 討論

本研究依靠芘熒光探針?lè)ńY(jié)合Origin軟件擬合曲線(xiàn)，研究了不同類(lèi)型膠束的聚集行為。發(fā)現(xiàn)提高磷脂的含量，可以顯著降低混合膠束的臨界膠束濃度。這可能與加入磷脂后降低了分子間斥力、增加聚合作用[11]，從而使得膠束更容易形成有關(guān)。另外，磷脂本身的輔助治療作用，也提示應(yīng)在保證一定溶解度的情況下，適當(dāng)提高藥物傳遞系統(tǒng)中的磷脂含量。

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The Study of Aggregation Behavior of Bile Salt－phosphatidylcholine Mixed Nano－micelle by Pyrene Fluorescence Probe Spectrometry Methods and Curve Fitting

Lu Guoqing1，2，Zheng Jiang3，Zheng Xinchuan3，Lu Yonglin3，He Fengci1
(1.Division of Scientific Research Affairs，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China;
2.Department of Clinical pharmacy，Chengdu Miilitary General Hospital，Chengdu 610083，China;
3.Medical Research Center， Southwestern Hospital， Third Military Medical University， Chongqing 400038， China)

ObjectiveThe aim of current study was to study the aggregation behavior of bile salt－phosphatidylcholine mixed nano－micelle prepared by different phospholipid fraction.MethodsThe fluorescence spectra of different phospholipid fraction of bile salt－ phosphatidylcholine mixed nano－micelle were measured，in which pyrene was solubilized and used as fluorescence probe.I1/I3(I1=372 nm，I3=383 nm)，according to the curves of fluorescence spectra，was taken as Y －axis and logC as X －axis simultaneously.The plot of pyrene versus bile salt－phosphatidylcholine mixed nano－micelle was S－Curve drawn by Origin softwear 8.0 through curve fitting.The intersection point of two tangents to curve was considered as critical micelle concentration.ResultsThe critical micelle concentration of bile salt－ phosphatidylcholine mixed nano－micelle with different phospholipids fraction(2 ∶1，1 ∶1，1 ∶2)were respectively 0.034，0.048，0.055 g/L.ConclusionThe results indicated that increasing phospholipid fraction had lower critical micelle concentration and better solubilization.

pyrene;fluorescence probe;bile salt;phospholipid;critical micelle concentration

R944.9

A

1006－4931(2011)10－0021－03

何鳳慈，男，教授，本文通信作者，(電子信箱)furan19@126.com。

2010－06－02)