鮑文韜 楊蘇民

(1. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266021; 2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院呼吸重癥科， 山東 泰安 271000)

隨著心臟科醫(yī)師手術(shù)及經(jīng)皮冠狀動脈介入治療( PCI) 的廣泛開展，缺血再灌注損傷成為臨床中必須面對的難題。在早期心外科手術(shù)中，通過改變再灌注的條件和狀態(tài)來預(yù)防再灌注損傷，如再灌注時的壓力、灌注液的溫度和成分等。1986 年，Murry等[1-2]首次提出缺血預(yù)處理(IPC)的概念，并且經(jīng)研究證實在離體模型和活體動物中均有心臟保護作用。我國學(xué)者高峰、趙志清等[3-4]提出了缺氧后處理的概念和經(jīng)典的缺血后處理(IPo) 概念，并用實驗證實IPo與IPc對再灌注后心肌具有類似的保護效果,是機體另一種內(nèi)源性抗再灌注損傷的保護措施。但在臨床上由于不易操作等原因，機械后處理無法廣泛使用。左旋卡尼汀是已經(jīng)應(yīng)用于臨床的藥物，它對缺血心肌有多重保護作用，特別是能促進再灌注期糖的有氧氧化，調(diào)節(jié)糖、脂肪酸氧化的平衡，改善心肌的能量代謝。缺血心肌常伴有卡尼汀含量的不足，因此對缺血心肌而言，左旋卡尼汀就顯得尤為重要，在臨床應(yīng)用中有著較為廣闊的前景。本研究探討在心臟離體情況下, 應(yīng)用左旋卡尼汀預(yù)處理聯(lián)合后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響, 為臨床心肌缺血性疾病的保護和治療提供基礎(chǔ)的研究資料。

1 材料與方法

1.1材料 雄性Wistar大鼠40只，體重250～300 g，購于泰山醫(yī)學(xué)院實驗動物中心(許可證號SCXK魯20050015))。左旋卡尼汀(L-CN)注射液由常州蘭陵制藥有限公司生產(chǎn)(5 ml/g，批號為0003271)。CK、LDH 試劑盒購自南京建成生物工程研究所，氯化三苯基四氮唑(TTC)購自上?；瘜W(xué)試劑公司，余試劑及設(shè)備由泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院中心實驗室提供。

1.2動物模型制備 動物3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。肝素鈉(3 mg/kg)充分肝素化1 min后迅速開胸，取出心臟，置于4℃的K-H液中簡單修剪多余的血管及脂肪組織。打開Langendorff離體心臟灌注系統(tǒng)，調(diào)整流量至15 ml/min，充分排氣后將灌注管道插入主動脈，保證灌注管道開口插入主動脈深度不超過主動脈瓣口，打結(jié)固定，開始灌注。行逆行主動脈恒溫恒壓灌注，溫度控制在(37±0.2)℃，pH 7.35～7.45，灌注壓75 cmH2O，并于灌注過程中持續(xù)通入95%O2和5%CO2混合氣體。在肺動脈圓錐處剪一小口，使冠脈流出液自然流出。以左冠狀動脈主干( LAD)為標志，在左心耳根部下緣約2 mm處，在冠狀動脈前降支根部穿一細結(jié)扎線，在肺動脈圓錐旁穿出，結(jié)扎時采用直徑 0.2 cm細塑料管穿過結(jié)扎線，收緊或松開結(jié)扎線以造成心肌缺血再灌注模型。在該結(jié)扎線下方約 0.5 cm處再穿一結(jié)扎線，以備結(jié)扎。心肌功能測量：剪開左心房經(jīng)二尖瓣置一聚乙烯球囊于左心室內(nèi)，通過導(dǎo)管和 BL-420E+生物機能儀連接，向球囊內(nèi)注入適量生理鹽水使左室舒張末壓( LVEDP)為 5～10 mmHg，并維持實驗始終。避免球囊內(nèi)混有氣泡。選擇心臟標準: 平衡灌注末HR> 160次/min, LVSP>75 mmHg，每分鐘室性早搏< 2個，不符合上述標準者舍棄后另補充。

1.3實驗分組 (1)對照組( Con): 平穩(wěn)灌流15 min后，左冠狀動脈前降支(LAD)阻斷45 min, 復(fù)灌120 min；(2) 缺血后處理組(IPo): 在復(fù)灌開始，LAD給予6次短暫開放/鉗夾(開/夾各10秒)；(3)藥物后處理組(LIPO): L-CN 10 mol/L于復(fù)灌時給予10 min；(4)藥物預(yù)處理組(LIPc): 在LAD阻斷前先給予10 min的L-CN；(5)聯(lián)合處理組(LIPP): LAD阻斷前后分別給予10 min的L-CN。

1.4觀測指標 收集再灌注30、60、120 min時冠脈流出液量(收集3 min冠脈流出液取平均值，CF)，液氮罐內(nèi)保存，實驗結(jié)束后整批測量再灌注60 min時LDH及CK水平。再灌注 2 h結(jié)束后，再次原位結(jié)扎左冠狀動脈前降支，從主動脈根部灌注1% Evans藍溶液約2 ml左右。非缺血區(qū)藍染后，用冰凍生理鹽水沖洗，之后凍于-20℃冰箱。30 min后用吉列刮胡刀片垂直于心臟長軸將其切成1～2 mm厚的薄片，置于1%TTC(pH 7.4)PBS溶液中，37℃避光孵育15～30 min后置于10%的甲醛溶液過夜。次日，將已染色的心肌薄片用濾紙吸干后按序放置于平板上，其中正常的非缺血心肌組織被Evans藍染為藍色，有缺血危險但未梗死的心肌組織被TTC染為紅色，梗死區(qū)呈灰白色，分離后分別稱重，梗死范圍以梗死心肌重量與缺血心肌重量之比表示。

2 結(jié) 果

2.1灌注前及平穩(wěn)灌流復(fù)灌后60 min時CK及LDH比較 CK及LDH在缺血再灌注前各組之間無明顯差異。再灌注60 min后，與Con組比較，CK值在IPo、LIPo、LIPc和LIPP組顯著降低，說明單純機械后處理及藥物預(yù)處理、后處理具有明顯的心肌保護作用。IPo、LIPo、LIPc和LIPP各組間心肌保護作用無明顯差異。與Con組比較，在灌注60 min后LDH 在LIPo、LIPc、LIPP組顯著下降，而后三組之間無明顯差異，說明預(yù)處理、后處理及聯(lián)合處理對心臟LDH影響無明顯差異。見表1。

2.2各時間點CF的比較 各組在灌注前基礎(chǔ)值無明顯差別，復(fù)灌30 min、60 min后Con 同IPo、LIPo、LIPc及LIPP組相比均具有明顯差異。復(fù)灌到120 min時，LIPo組CF值與其他各組相比P<0.05，說明LIPo可能較其它處理組具有更長的改善冠脈流量的作用。見表2。

2.3各時間點HR的比較 在灌注開始前各組心率無明顯差異。而再灌注60 mim時，其他各處理組與Con相比P均<0.05，各處理組之間無明顯差異。見表3。

表1 灌注前及再灌注60 min 時CK 及LDH比較

注：與Con比較，aP<0.05，bP<0.01。

表2 平穩(wěn)后及復(fù)灌各時間點CF比較

注：與Con比較，*P<0.05; 與LIPo比較，#P<0.05。

表3 平穩(wěn)后及復(fù)灌各時間點HR比較(次/分)

注：與Con比較，aP<0.05。

2.4各組在心肌風險區(qū)范圍比較 再灌注結(jié)束，行心肌梗死測定表明，各組在心肌風險區(qū)范圍比較無明顯差異。LIPo 組心肌梗死區(qū)重量從(34.39±1.62)%下降到(28.02±3.10)%(P<0.05)， LIPo、LIPc及LIPP之間無明顯差異。

3 討 論

缺血再灌注損傷日益引起臨床醫(yī)師們的關(guān)注，其損傷的重要因素可能與鈣離子超載、氧自由基和中性粒細胞聚集等因素[5-6]有關(guān)，也與心肌細胞的能量產(chǎn)生及利用障礙緊密相關(guān)。左旋卡尼汀是已用于臨床的藥物，它對缺血心肌有多重保護作用，其保護缺血心肌的作用機制可能主要為：通過減少缺血期長鏈脂酰肉堿(LCAC) 的堆積減輕了LCAC 對心肌的毒性作用；保護血管內(nèi)皮細胞，保障心臟的血液供應(yīng)；左旋卡尼汀能增強心肌清除自由基的能力，阻止氧化應(yīng)激造成的心肌細胞損傷等。

本實驗中左旋卡尼汀預(yù)處理、后處理及聯(lián)合處理的冠脈流量和對照組相比具有顯著改變，其中左旋卡尼汀后處理組，120 min后冠脈流量與對照組有顯著性差異，說明左旋卡尼汀后處理能有效的保護血管內(nèi)皮細胞，擴張冠脈，增加冠脈流量。而隨著時間的延長，機械預(yù)處理、藥物預(yù)處理及聯(lián)合處理冠脈保護作用明顯較左旋卡尼汀后處理組減弱，其具體原因及機制需進一步研究。而除對照組外，其余各組之間對CK和LDH的影響無明顯差異。說明各組均有心肌保護作用，但預(yù)處理結(jié)合后處理無明顯的保護疊加作用。同時，左旋卡尼汀預(yù)處理、后處理可以明顯改善缺血再灌注后心肌梗死的發(fā)生率。

總之，左旋卡尼汀對心肌缺血-再灌注損傷有保護作用，能進一步改善心肌細胞的能量代謝和缺血-再灌注心肌的心功能，增加冠狀動脈的血流量，減輕心肌細胞的損傷，對心肌缺血-再灌注損傷有保護作用，為左旋卡尼汀應(yīng)用臨床提供了理論基礎(chǔ)。

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