梁 浩 孫成龍 韓衍銀 李 珂 齊永秀

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271016 )

阿托伐他汀鈣(Atorvastatin Calcium)，又名立普妥，為羥甲基戊二酸單酰輔酶 A(HMG-CoA)還原酶選擇性抑制劑，通過抑制HMG-CoA還原酶和膽固醇在肝臟的生物合成而降低血漿膽固醇和脂蛋白水平，并能通過增加肝細(xì)胞表面低密度脂蛋白(LDL)受體數(shù)目而增加LDL的攝取和分解代謝。阿托伐他汀鈣能夠降低血漿膽固醇和脂蛋白水平，減少低密度脂蛋白的生成。臨床上用于家族性高膽固醇血癥、混合性高脂血癥等癥。隨著阿托伐他汀鈣臨床應(yīng)用越來越廣，聯(lián)合用藥越來越多，對阿托伐他汀鈣的研制和開發(fā)也越來越受到重視。目前，對阿托伐他汀鈣的臨床聯(lián)合用藥研究較多，而用高效液相色譜法測定其血藥濃度的研究相對較少。本實驗建立一種快捷、高效、高選擇性測定阿托伐他汀鈣血藥濃度的高效液相色譜法，對深入研究阿托伐他汀鈣的藥動學(xué)規(guī)律，指導(dǎo)臨床合理用藥以及聯(lián)合用藥具有重要意義。

1 儀器與試藥

LC-10AT高效液相色譜儀(SPD-10A檢測器、N2000雙通道色譜工作站、手動進(jìn)樣器，日本島津公司)；GR-202電子分析天平(日本AND公司)；XW-80A型微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；TGL-16G飛鴿離心機(jī)(上海化工機(jī)械廠有限公司)；PHS-29A酸度計(上海精科科學(xué)儀器有限公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

阿托伐他汀鈣對照品(批號：100590-200802，規(guī)格：100 mg，中國藥品生物制品檢定所); 丹皮酚對照品(批號：110708-200506，規(guī)格：200 mg，中國藥品生物制品檢定所);乙腈，色譜純；甲醇，分析純；高純氮?dú)?；重蒸水?/p>

Wistar大鼠，購自山東大學(xué)實驗動物中心，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料常規(guī)喂養(yǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

高效液相色譜儀(日本島津公司)，C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈：醋酸銨(冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.0)(50︰50)作流動相，流速1.0 ml·min-1；檢測波長246 nm；柱溫，室溫。

2.2 藥品與試劑的配制

2.2.1醋酸銨緩沖液(pH=4)的配制 精密稱取醋酸銨0.7696 g，置于500 ml燒杯中，加入重蒸水500 ml，冰醋酸調(diào)節(jié)pH為4，混合膜(0.45 mm)抽濾。

2.2.2阿托伐他汀鈣對照品儲備液的配制 精密稱取阿托伐他汀鈣對照品適量，置于25 ml容量瓶中得阿托伐他汀鈣對照品儲備液(100 μg·ml-1);精密量取阿托伐他汀鈣儲備液1 ml于10 ml容量瓶中，甲醇定容得阿托伐他汀鈣儲備液A(10 μg·ml-1)；精密量取阿托伐他汀鈣儲備液A(10 μg·ml-1)1 ml于10 ml容量瓶中，甲醇定容，得阿托伐他汀鈣儲備液B(1 μg·ml-1)。

2.2.3內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取丹皮酚適量，置于50 ml容量瓶中，加甲醇定容，得內(nèi)標(biāo)溶液10 μg·ml-1。

2.3 空白血清的制備

取常規(guī)飼養(yǎng)的健康Wistar大鼠，尾尖取血，自然凝血后，離心分離血清備用。

2.4 樣品預(yù)處理

取待測血清100 μl置于離心管中，準(zhǔn)確加入10 μg·ml-1的丹皮酚500 μl和需求量的阿托伐他汀鈣儲備液A或B，渦旋3 min，離心10 min(12000 r·min-1)，取上清液移至另一離心管中，氮?dú)獯蹈?，殘余?00 μl甲醇復(fù)溶，取20 μl進(jìn)樣。

2.5 方法的專屬性

取空白血清和含有阿托伐他汀鈣及內(nèi)標(biāo)的含藥血清，按“樣品預(yù)處理”方法處理，分別取經(jīng)處理的空白血清和含藥血清各20 μl進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。阿托伐他汀鈣的色譜峰保留時間為9.58 min，丹皮酚的色譜峰保留時間為7.68 min，兩者完全分離。血清內(nèi)源性物質(zhì)對阿托伐他汀鈣和丹皮酚的色譜峰無干擾。

A

B

2.6 系統(tǒng)適用性與最低檢測限

按阿托伐他汀鈣的色譜峰計算，理論塔板數(shù)為3700。阿托伐他汀鈣與丹皮酚的分離度為3.20，丹皮酚與相鄰血清內(nèi)源性物質(zhì)峰的分離度為5.21，兩分離度均大于1.5(中華人民共和國藥典規(guī)定)。當(dāng)S/N=10時，阿托伐他汀鈣的最低檢測限是0.25 μg·ml-1。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系

取7支標(biāo)準(zhǔn)刻度離心管(1 ml)，分別標(biāo)號為1、2、3、4、5、6、7，精密移取10 μg·ml-1阿托伐他汀鈣儲備液250 μl、100 μl、50 μl于1、2、3號離心管中；精密移取1 μg·ml-1阿托伐他汀鈣儲備液250 μl、100 μl、50 μl、25 μl于4、5、6、7號離心管中，然后依次加入10 μg·ml-1丹皮酚500 μl和血清100 μl，甲醇定容至1 ml，混勻，配制成含阿托伐他汀鈣濃度依次為25.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0.5、0.25 μg·ml-1，按“樣品預(yù)處理”方法處理，各取20μl進(jìn)樣，記錄色譜圖，計算阿托伐他汀鈣與丹皮酚的峰面積比Y，以Y為縱坐標(biāo)，阿托伐他汀鈣濃度X為橫坐標(biāo)作圖，計算回歸方程Y=1.215X+0.0351，r=0.9951(n=7)，表示在0.25～25 μg·ml-1范圍內(nèi)，阿托伐他汀鈣濃度與峰面積比線性關(guān)系良好。

2.8 方法回收率試驗

精密移取阿托伐他汀鈣儲備液適量于1 ml離心管中，配制低、中、高3個濃度(0.1 μg·ml-1、1 μg·ml-1、10 μg·ml-1)的血清樣品各3份。照樣品預(yù)處理方法處理，取20μl進(jìn)樣，記錄色譜圖，得相應(yīng)的峰面積比As(H)/Ai(H)；另取阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)液，用流動相稀釋成相同濃度的阿托伐他汀鈣對照品溶液各3份，照樣品預(yù)處理方法處理，取20μl進(jìn)樣，記錄色譜圖，得相應(yīng)的峰面積比As(D)/Ai(D)。按提取回收率=[ As(H)/Ai(H)]/[ As(D)/Ai(D)]x100%計算，低、中、高3個濃度樣品的提取回收率分別為91.3%、89.8%、87.1%。

2.9 精密度試驗

將阿托伐他汀鈣濃度為0.1 μg·ml-1、1 μg·ml-1、10 μg·ml-1的含藥血清照“樣品預(yù)處理”方法處理，在1d內(nèi)重復(fù)測定3次和3d內(nèi)重復(fù)測定3次，以測定方法的精密度。結(jié)果見表1。

表1 方法精密度試驗結(jié)果

3 討 論

3.1 色譜條件的選擇

在色譜條件的選擇過程中，重點(diǎn)對流動相組成進(jìn)行了篩選和比較。確定選用乙腈-醋酸銨(50︰50)作流動相，在該色譜條件下，丹皮酚、阿托伐他汀鈣分離完全，色譜峰峰形對稱，理論塔板數(shù)高，丹皮酚與阿托伐他汀鈣的保留時間分別是7.68 min和9.58 min，均在10 min以內(nèi)，樣品測定周期較短，且在此色譜條件下，血清中內(nèi)源性物質(zhì)出峰集中在1～3 min，對內(nèi)標(biāo)和藥品峰無干擾。表明本方法具有專一性強(qiáng)和快速的特點(diǎn)，適合于阿托伐他汀鈣的血藥濃度檢測。

3.2 內(nèi)標(biāo)物的確定

以乙腈-醋酸銨(50︰50)，調(diào)節(jié)pH為4作流動相，丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在此條件下峰形較好且保留時間適中[7]，故選丹皮酚作內(nèi)標(biāo)物，具有性質(zhì)穩(wěn)定、回收率高的特點(diǎn)，能滿足樣品測定的需要。

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