馮曉東，周海華，常海飛，黑淑梅

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

馬齒莧(Portulaca oleraceaL.)屬一年生肉質(zhì)草本植物，又稱馬齒草、馬齒、五行草等，分布于我國(guó)大部分地區(qū)，馬齒莧中富含維生素、蛋白質(zhì)、多糖、有機(jī)酸等主要營(yíng)養(yǎng)成分，因此具有食用和藥用雙重價(jià)值［1］。隨著人們對(duì)馬齒莧化學(xué)成分的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)馬齒莧中含有多種活性因子，對(duì)人體有著多種保健及疾病治療作用，黃酮類化合物就是馬齒莧中主要的活性因子之一，它有多種藥理活性，如擴(kuò)張冠狀血管、降低血壓、止咳去痰、抗菌消炎、抗毛細(xì)血管脆性等，除此而外它還有抗氧化、抗衰老等作用［2］，馬齒莧對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌以及某些致病性真菌有抑制作用;馬齒莧所含的去甲腎上激素能促進(jìn)胰島素的分泌，從而起到調(diào)節(jié)血糖的作用;還含有α－亞麻酸、ω－脂肪酸，具有降低血脂抗動(dòng)脈粥硬化的作用［3］。有關(guān)馬齒莧中黃酮類化合物的提取和含量測(cè)定報(bào)道很多，但對(duì)延安地區(qū)馬齒莧中黃酮類的研究還未見(jiàn)報(bào)道，本研究探討了馬齒莧中總黃酮的提取方法及最佳提取條件，并對(duì)延安地區(qū)馬齒莧中總黃酮進(jìn)行了定量測(cè)定，以期為延安地區(qū)馬齒莧的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬齒莧，二〇〇八年八月采于陜西延安。將新鮮馬齒莧全草洗凈，晾至表面無(wú)水分，分別置于恒溫干燥箱中，80℃下恒溫干燥，粉碎過(guò)60目篩［4］，備用。

1.2 儀器與試劑

FW80微型高速萬(wàn)能試樣粉碎機(jī);JY96－Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī);HX－1050恒溫循環(huán)器;722N可見(jiàn)分光光度計(jì);CS101－2電熱鼓風(fēng)干燥箱;MP200A電子天平;索氏提取器。

蘆丁(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司出品，純度≥95.0%)，乙醇，NaNO2，Al(NO3)3，NaOH，所用試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 馬齒莧總黃酮的測(cè)定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法［5］測(cè)定。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的制備 精密稱取干燥至恒重的蘆丁200 mg，置于100 mL的容量瓶中，加70%乙醇適量，放置于恒溫水浴鍋上微熱，輕輕搖動(dòng)容量瓶，使其溶解，待溶解冷卻后加70%乙醇至刻度線，搖勻。精密量取上述試液10.0 mL置100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀飾至刻度，搖勻。即得每1 mL含無(wú)水蘆丁0.2 mg。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于 50 mL容量瓶中，各加水12 mL，分別加入5%NaNO2溶液2 mL搖勻，放置6 min后，然后分別加入10%Al(NO3)3溶液2 mL，搖勻放置6 min，后分別加入4%NaOH溶液20 mL，最后分別加蒸餾水至刻度、搖勻，靜置15 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，每濃度重復(fù)3次。得回歸方程為:y=10.804x－0.0025(y為吸光度，x為蘆丁濃度mg/mL)。

1.3.4 樣品中總黃酮含量的提取與測(cè)定 稱取不同部位(莖或葉)中的馬齒莧干粉1 g分別溶于置有不同體積不同濃度乙醇溶液的小燒杯中攪拌混勻，于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中粉碎一定時(shí)間后趁熱過(guò)濾，將溶液定容至50 mL，取1 mL于50 mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法操作，最后用蒸餾水定容，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定溶液的吸光度;將過(guò)濾后的濾渣包好用索氏提取法提取，提取至提取室無(wú)色為止［5］，過(guò)濾提取液用70%乙醇重新定容至50 mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法顯色，最后用蒸餾水定容，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度。

1.3.4 樣品含量的計(jì)算 將兩次測(cè)定的吸光度值分別代入回歸方程得提取液中總黃酮的含量。

黃酮含量=c1(mg/mL)×50×50 mL+c2(mg/mL)×50×50 mL。

總黃酮得率(%)=［c1(mg/mL)×50×50 mL+c2(mg/mL) ×50×50 mL］/1000 mg。

其中:c1為超聲波細(xì)胞破碎器提取后測(cè)得的濃度，c2索氏提取后測(cè)得的濃度。

表1 超聲波細(xì)胞破碎法提取總黃酮正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 正交試驗(yàn) 在超聲波細(xì)胞破碎提取中，選擇主要影響提取效率的提取時(shí)間(A)、料液比(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)為考察因素，每個(gè)因素三個(gè)水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1。稱取馬齒莧干粉9份，每份0.987 g，按表1設(shè)計(jì)的工藝條件進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎提取，提取液按上述1.3.3方法測(cè)定總黃酮的含量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)極差分析表明:3個(gè)因素對(duì)超聲波破碎法提取馬齒莧中類黃酮物質(zhì)提取效果的影響主次順序?yàn)?料液比＞乙醇濃度＞提取時(shí)間，即料液比的影響最大，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取時(shí)間的影響最小，得到最佳提取條件是C2B3A3，即:料液比為1 g∶20 mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%、提取時(shí)間為40 min。

方差分析表明，料液比和乙醇濃度對(duì)總黃酮的提取有顯著影響，與直觀分析結(jié)果一致。

2.2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知總黃酮含量的馬齒莧供試品溶液1.0 mL，分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“1.3.4”方法測(cè)定實(shí)際含量，結(jié)果平均回收率為98.3%，RSD=2.13%(n=5)。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析表

2.3 馬齒莧中總黃酮的含量

在上述最佳提取條件下，經(jīng)3次重復(fù)得出了初次提取的提取率，再用索氏提取器提取超聲波提取后濾渣中的總黃酮，得出馬齒莧中總黃酮的含量結(jié)果如表4。結(jié)果總黃酮提取百分率分別為5.61，5.63，5.64，均高于正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，說(shuō)明優(yōu)選出的工藝條件是穩(wěn)定可行的。

表4 延安地區(qū)馬齒莧中總黃酮的含量

3 討論

(1)從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，影響超聲波細(xì)胞粉碎法提取馬齒莧中黃酮類化合物主次順序?yàn)?料液比＞乙醇濃度＞提取時(shí)間，因?yàn)樘崛r(shí)間對(duì)總黃酮的提取相對(duì)較小，生產(chǎn)實(shí)踐中，為了降低成本，可取提取時(shí)間為30 min，即:料液比為1g∶20 mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%、提取時(shí)間30 min。

(2)超聲波細(xì)胞破碎法結(jié)合索氏提取法減少了提取次數(shù)，整個(gè)過(guò)程提取時(shí)間大約為4 h，提取用時(shí)較短，是總黃酮提取中的一種可行的方法。

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［3］劉潔，李春艷.馬齒莧對(duì)高脂血癥大鼠血脂水平的影響［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2004，8(30):6678－6679.

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