錢明 袁君君 傅劍釗 周劍輝 舒曉春

HCV-RNA抗-HCV和ALT聯(lián)合檢測在丙肝中診斷的應(yīng)用

錢明 袁君君 傅劍釗 周劍輝 舒曉春

目的探討丙肝(抗-HCV)陽性人群中，其丙型肝炎病毒核酸(HCV RNA)含量與丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的關(guān)系。方法采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)技術(shù)檢測222例丙型肝炎病毒感染者血清HCV RNA含量，采用酶聯(lián)免疫法檢測抗-HCV，采用酶法檢測其ALT水平。結(jié)果222例抗-HCV陽性標本中135例HCV RNA陽性(＞500拷貝/ml)，陽性率為60.8%，120份標本ALT異常(＞40U/L)，異常率為54%，ALT水平及異常率隨HCV RNA含量的升高而增加。結(jié)論ALT水平及異常率與HCV RNA之間呈正相關(guān)，提示ALT水平可間接反映HCV在肝臟的復(fù)制程度，HCV-RNA含量與抗-HCV同時檢測可以提高臨床對丙型肝炎的診斷，HCV-RNA是反映HCV復(fù)制的可靠指標，結(jié)合ALT生化指標結(jié)果可幫助臨床了解HCV在體內(nèi)的復(fù)制狀況。

丙型肝炎;丙肝抗體;丙型肝炎病毒核酸

全球丙肝感染率約為3%，大約117億人感染了HCV，每年新發(fā)丙型肝炎病例315萬例［1］。慢性丙肝患者10年內(nèi)約有20%發(fā)展為肝硬化，肝硬化患者每年約有3%發(fā)展為肝細胞癌［2］。因此早期診斷和及時治療尤為重要。HCV-RNA含量與抗-HCV同時檢測可以提高臨床對丙型肝炎的診斷，本文檢測了222例抗-HCV陽性的血清標本，探討與HCV-RNA，ALT含量之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料中山大學(xué)第五附屬醫(yī)院2005年至2009年除甲、乙、戊型肝炎患者、無肝臟腫瘤、無非特異性免疫原性肝病患者外，丙型肝炎病毒感染的住院或門診患者222例。其中男166例，女56例;年齡7～77歲，平均為37.8歲。

1.2 標本采集抽取EDTA-K2抗凝外周靜脈血2 ml用于HCV RNA定量檢測，及促凝外周靜脈血2 ml用于ALT檢測。

1.3 檢測方法

1.3.1 HCV RNA測定采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQPCR)技術(shù)檢測，儀器采用美國生產(chǎn)的MJ Research 2全自動熒光定量PCR儀。試劑由深圳匹基生物工程公司提供。操作按試劑盒說明書進行。HCV RNA含量的陰性參考值＜500拷貝/ml。

1.3.2 ALT測定采用酶法在日立7170型全自動生化分析儀上檢測，所有操作按照試劑盒上說明書進行。試劑由上?？迫A東菱診斷用品有限公司提供。ALT血清含量＜40U/L為正常。

1.3.3 抗-HCV測定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測，所有操作按照試劑盒上說明書進行。試劑由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司提供。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，對ALT采用相關(guān)分析P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清HCV RNA含量變化與ALT的關(guān)系(表1)。

從表1可以看出，135例HCV RNA含量＞500拷貝/ml的標本中，92例ALT水平異常，其ALT水平及異常率隨HCV RNA含量的升高而增加，經(jīng)相關(guān)性分析，ALT水平及異常率與HCV RNA含量呈正相關(guān)性(r=0.986，P＜0.005)

2.2 血清HCV RNA含量對222例抗-HCV陽性測定血清HCV RNA含量，結(jié)果為87例陰性，135例為陽性，含量為5× 102～5×107拷貝/ml，在135例HCV-RNA陽性標本中，有43例ALT水平正常，92例ALT水平異常。在HCV-RNA陽性組中，ALT正常組與異常組比較見表2。從表2可以看出，HCV-RNA陽性時肝功異常68.2%明顯高于HCV-RNA陰性時32.2%。而222例抗-HCV陽性患者中有(60.8%)的患者HCV-RNA都為陽性。

表1135 個陽性標本血清HCV RNA含量變化與ALT的關(guān)系

表2 ALT正常組與異常組在135例HCV-RNA陽性標本中的比較(例，%)

3 討論

丙型肝炎病毒感染是肝硬化和肝癌的重要病因，因此盡早診斷、合理治療丙肝尤為重要。目前診斷主要依靠抗HCVIgG及HCV RNA的檢測。但由于抗-HCV檢測存在窗口期、不能區(qū)別現(xiàn)癥感染和既往感染、受機體免疫水平影響等缺陷［3］，不能及時診斷出病毒感染，而熒光定量PCR檢測HCV RNA含量，可直接反映體內(nèi)HCV的活動和復(fù)制程度等優(yōu)點，有利于及時診斷。近年來許多研究表明，丙肝發(fā)病過程中肝炎病毒感染使機體免疫系統(tǒng)活化，這些活化的細胞可與因肝炎病毒感染而改變的肝細胞膜成分發(fā)生免疫應(yīng)答，從而造成肝功的改變和肝細胞的壞死［4］。表1通過血清HCV RNA含量及ALT檢測結(jié)果的比較，從分子學(xué)定量角度證實了HCV RNA含量與ALT水平呈正相關(guān)，與相關(guān)研究［5-7］報告一致。ALT異常率也與HCV RNA含量呈正相關(guān)，也說明了HCV RNA是在肝細胞中復(fù)制，對細胞產(chǎn)生直接或間接的損害。而表2HCV-RNA陽性時肝功異常68.2%明顯高于HCV-RNA陰性時32.2%。而222例抗-HCV陽性患者中有(60.8%)的患者HCV-RNA都為陽性。本文中出現(xiàn)的ALT水平異常，HCV RNA陰性可能由于:①丙型肝炎患者血清中病毒含量低，且具有一定波動性，在未經(jīng)干擾素治療的患者中HCV RNA可呈間歇性陽性;②HCV RNA十分脆弱，易被白細胞含有的RNA酶降解;③HCV RNA不像HBV DNA那樣不受進食的影響，HCV易與迅速增高的血中脂質(zhì)及脂蛋白相結(jié)合致使檢出率下降;④HCV RNA的PCR包括從RNA到DNA的轉(zhuǎn)錄，第一次PCR及第二次PCR，其中任何步驟的問題均影響其檢出［8］。同樣的，本文也出現(xiàn)了HCV-RNA陽性，ALT水平正常的情況，這也與近年來一些研究相符合，其研究顯示部分患者血清HCV-RNA含量高，但肝臟組織僅呈輕度或中度損傷。但也有個別HCV-RNA很低，卻出現(xiàn)較嚴重的肝臟組織損傷，提示HCV對肝臟的損傷可能是由于免疫應(yīng)答所造成的，免疫應(yīng)答反應(yīng)在HCV感染的發(fā)病機制中具有重要作用［9］。本文中也出現(xiàn)有抗-HCV陽性，HCV RNA陰性的情況，可能由于:①有些病例經(jīng)過病毒治療，使病毒復(fù)制減慢或停止，血清中的HCV RNA載量低于最少可檢出值，抗-HCV在體內(nèi)存在時間長(1～10年)，故可出現(xiàn)抗-HCV陽性，HCV RNA陰性;②由于ELISA試劑盒上包被有多種抗原成分，能檢測出機體針對不同區(qū)域抗原產(chǎn)生的多種抗體;③急性丙肝感染恢復(fù)期，HCV復(fù)制停止，HCV-RNA消失，但抗-HCV持續(xù)存在?？?HCV是HCV感染與既往感染的間接指標，但HCV感染后到抗體轉(zhuǎn)陽一般有一個較長的窗口期，平均為70 d，約1%～3%的患者抗-HCV可持續(xù)陰性，而且抗-HCV檢測存在不能區(qū)別現(xiàn)癥感染和既往感染、受機體免疫水平影響等缺陷。HCV RNA是HCV復(fù)制活躍的可靠指標，在感染HCV 1～2周內(nèi)，血清中即可檢測到HCV RNA，該技術(shù)大大縮短了檢測丙肝“窗口期”，可以判斷疾病是否處于隱性及亞臨床狀態(tài)，而且FQ-PCR檢測HCV-RNA的整個過程均在完全封閉狀態(tài)下進行，能有效的克服擴增產(chǎn)物的污染造成的假陽性，特異性與靈敏度高，易為基礎(chǔ)實驗室接受。但由于丙型肝炎病毒的遺傳物質(zhì)為RNA，容易受到外界RNA酶的影響，可能出現(xiàn)假陰性。ALT在肝細胞中含量較多，當肝臟遭到損害時，此酶釋放到血液中，故作為診斷肝炎的一項重要指標。但有時ALT與肝臟受損情況并不相符，尤其是HCV病毒直接作用于肝臟，對肝臟造成的破壞是隱匿的。血清ALT濃度升高不能單獨由病毒載量決定，還取決于個體的免疫應(yīng)答能力。綜上所述，單一地檢測抗-HCV或者HCV-RNA含量從而確定丙型肝炎病毒感染存在一定風險，因此建議在以HCV RNA為重要檢測指標診斷HCV時，應(yīng)聯(lián)合檢測分析抗-HCV和ALT等。

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Clinical application HCV-RNA anti-HCV And ALT examination in diagnosis of patients with HCV

QIAN Ming，YUAN Jun-jun，F(xiàn)U Jian-zhao，et al．Laboratory Department of the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Zhuhai 519000，China

ObjectiveTo discuss the relationship between the HCV-RNA levels and ALT levels in the HCV masculine crowd.MethodsFluorescent Quantitative PCR methodswere used to detect the quantify of HCV-RNA in 222 anti-HCV masculine samples，the ALT were detected by automatic biochemistry analyzer. ResultsIn 222 cases anti-HCV masculine samples，135 cases were positive of HCV-RNA and 120 cases were positive of ALT.Masculine gender rate of HCV-RNA was 60.8%.ALT rate of abnormality was 54%.The ALT level and the rate of abnormality content ascension increased along with the HCV-RNA.ConclusionThere was a corrlation between ALT levels and the concentration of HCV RNA.Prompted the ALT level to be possible to reflect HCV indirectly in the liver duplication degree，HCV-RNA levels and anti-HCV detection could improve the clinical diagnosis of hepatitis C，HCV-RNA is a reliable indicator to reflects HCV replication，combined with ALT biochemical results could help clinicians understand the status of HCV replication in the body．

HepatitiscHCV-RNA;Anti-HCV;HCV-RNA

519000珠海，中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院檢驗科

舒曉春E-mail:shuxc@163.com