鄭 超,吳海濤,孫曉川△

(1.重慶市江北區(qū)第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科 400020;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科 400016)

小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κ B與AQP4協(xié)同表達(dá)的研究

鄭 超1,吳海濤2,孫曉川2△

(1.重慶市江北區(qū)第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科 400020;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科 400016)

目的觀察原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞劃痕損傷后NF-κ B與水通道蛋白質(zhì)4(AQP4)表達(dá)的相關(guān)性?方法 原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞,用免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定其特異性表面標(biāo)記物巨噬細(xì)胞分化抗原-1(Mac-1)抗體?采用劃痕致傷構(gòu)建細(xì)胞損傷模型?于傷后12 h及1?3?5?7 d用RT-PCR檢測(cè) NF-κ B mRNA 的表達(dá),Western blot檢測(cè)AQP4蛋白的表達(dá)?結(jié)果傷后 12 h,NF-κ B?AQP4表達(dá)不顯著,1 d時(shí)表達(dá)達(dá)高峰,后逐漸降低,5?7 d時(shí)幾乎無(wú)表達(dá)?結(jié)論致傷后,NF-κ B與AQP4的表達(dá)具有協(xié)同性,炎癥反應(yīng)在創(chuàng)傷后腦水腫的發(fā)生?發(fā)展中發(fā)揮了重要作用?

小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;NF-κ B;水通道蛋白質(zhì)4;協(xié)同表達(dá)

創(chuàng)傷性腦水腫是創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)后主要的繼發(fā)性病理改變之一,也是導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高和傷者死亡的主要原因?近年來(lái),水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)與創(chuàng)傷性腦水腫的相關(guān)性逐漸引起人們重視?另有研究[1]表明,TBI急性期的炎癥反應(yīng)加重了腦組織水腫,介導(dǎo)了繼發(fā)性的組織損傷?本實(shí)驗(yàn)擬從介導(dǎo)炎癥反應(yīng)重要的轉(zhuǎn)錄因子——核因子-κ B(NF-κ B)與AQP4的協(xié)同表達(dá)進(jìn)行初步探討?

1 材料與方法

1.1 小膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng) 取出生2 d內(nèi)的sprague-dawley乳鼠4只(購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部),按McCarthy和 De Vellis[2]創(chuàng)立的區(qū)別接種技術(shù),分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞,并對(duì)其特異性表明標(biāo)志物巨噬細(xì)胞分化抗原-1(Mac-1)抗體進(jìn)行檢測(cè)?

1.2 細(xì)胞劃痕損傷模型的建立 參照文獻(xiàn)[3]的方法,將純化的小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)3×106～4×106后,以細(xì)小的微量移液器塑料滴頭于各培養(yǎng)孔內(nèi)劃傷培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞,劃傷長(zhǎng)度為20 mm,劃傷間距為3～4 mm,四橫四豎共八條劃痕,每孔劃傷位置盡量保持一致,劃傷寬度約1 mm?

1.3 半定量RT-PCR檢測(cè)NF-κ B mRNA的表達(dá) 分別在傷后12 h及1?3?5?7 d向細(xì)胞培養(yǎng)板中加入 TaKaRa RNAiso Reagent,反轉(zhuǎn)錄至cDNA;查閱Genebank,設(shè)計(jì)NF-κ B引物序列如下:上游引物 5′-TGT CAC TCA GGC TCT TCA CCC A-3′,下游引物 5′-TAG GCT CCC GTA TGC CCT CAC C-3′,使用Taq Mix(廣州東盛公司),PCR擴(kuò)增,片段長(zhǎng)度350 bp;GAPDH 上游 引物 序列 5′-TGA TGA CAT CAA GAA GGT GGT GAA-3′,下游引物序列 5′-TCC TTG GAG GCC ATG TAG GCC AT-3′,片段長(zhǎng)度 249 bp;取 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 5 μ L,1%瓊脂糖凝膠電泳,運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)成像并進(jìn)行分析,結(jié)果以NF-κ B/GAPDH吸光度比值表示?

1.4 Western blot檢測(cè)AQP4蛋白的表達(dá) 分別在傷后12 h及1?3?5?7 d向細(xì)胞培養(yǎng)板中滴加細(xì)胞裂解液(購(gòu)自上海生工),冰浴勻漿,離心取上清液;用 BCA法定量蛋白濃度,取 30 μ g上樣于SDS-PAGE中電泳2 h,轉(zhuǎn)移到PVDF膜,室溫封閉2 h;加入AQP4多克隆抗體(購(gòu)自武漢博士德,1∶200),4℃過(guò)夜,加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶4 000),室溫孵育1 h,加ECL試劑顯色;采用 4.1版本 Quantity one軟件(美國(guó) Bio-Rad公司)分析各條帶面積灰度值,β-action表達(dá)水平為內(nèi)參照?

2 結(jié) 果

2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞的分離?培養(yǎng)?鑒定結(jié)果 通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng),純化后的細(xì)胞純度達(dá)95%以上?倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察其特異性化學(xué)標(biāo)志物Mac-1抗體,均確認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)誤,見(jiàn)封3圖1～3?

2.2 傷后小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κ B mRNA表達(dá)的變化 傷后12 h NF-κ B表達(dá)不明顯,1 d時(shí)表達(dá)水平達(dá)到最高峰,3 d時(shí)表達(dá)量逐漸回落,5?7 d幾乎無(wú)表達(dá),見(jiàn)圖4?

2.3 傷后AQP4蛋白表達(dá)的變化 傷后12 h APQ4蛋白表達(dá)不明顯,1 d時(shí)表達(dá)水平達(dá)高峰,從第3天開(kāi)始,表達(dá)量逐漸回落,見(jiàn)圖5?

圖4 小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κ B mRNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

圖5 小膠質(zhì)細(xì)胞AQP4蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

2.4 傷后不同時(shí)間點(diǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κ B mRNA和AQP4蛋白表達(dá)的相關(guān)性 傷后12 h及1?3?5?7 d NF-κ B mRNA 和AQP4蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)相同,兩者具有明顯的相關(guān)性,見(jiàn)封3圖6?

3 討 論

AQP4是分布在腦組織的主要水通道蛋白,具有選擇性水轉(zhuǎn)逆功能[4]?Gresz等[5]研究結(jié)果顯示,AQP4 mRNA在膠原纖維酸性蛋白(GFAP)免疫活性陰性及陽(yáng)性細(xì)胞上都有表達(dá),提示小膠質(zhì)細(xì)胞也可能表達(dá)少量AQP4?AQP4通常以四聚體的形式發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),具有高速轉(zhuǎn)運(yùn)水的能力,比其他AQPs對(duì)水的通透性高3～4倍?

TBI后中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的細(xì)胞釋放具有神經(jīng)毒性的內(nèi)源性炎癥因子,引發(fā)繼發(fā)性炎癥反應(yīng),可促進(jìn)腦水腫的發(fā)生?顱內(nèi)創(chuàng)傷性炎癥反應(yīng)過(guò)程包括細(xì)胞因子的活化,補(bǔ)體系統(tǒng)的激活,趨化因子?黏附分子的分泌和白細(xì)胞聚集等?Schuhmann等[6]研究鼠皮質(zhì)沖擊傷后腦脊液白三烯與腦水腫?腦細(xì)胞炎癥反應(yīng)的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)白三烯B4(LTB4)的變化與白細(xì)胞侵入的時(shí)間過(guò)程相一致,提示 LTB4與細(xì)胞毒性水腫密切相關(guān)?Lu等[7]觀察到鼠閉合性頭外傷后廣泛的小膠質(zhì)細(xì)胞表面抗原上調(diào),包括補(bǔ)體3受體(CR3)和主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅱ級(jí)抗原,以及星型細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)伴血-腦屏障(BBB)的破壞?Whalen等[8]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血小板選擇素的同時(shí)缺失可以顯著減輕創(chuàng)傷后腦水腫,但沒(méi)有改善傷后腦功能,黏附分子在腦水腫產(chǎn)生機(jī)制中的作用似乎不依賴于腦內(nèi)白細(xì)胞的聚集?

TBI可導(dǎo)致死亡或殘疾,但臨床上對(duì)于TBI的治療及控制的方法卻很有限[9]?近年來(lái)隨著對(duì)TBI后腦水腫發(fā)病機(jī)制的深入研究,炎性細(xì)胞因子在 TBI中的作用成為研究熱點(diǎn)?目前炎性細(xì)胞因子已發(fā)展成為一個(gè)家族,它包括白細(xì)胞介素(ILs)?腫瘤壞死因子(TNF)?干擾素(INF)?生長(zhǎng)因子(GFs)?化學(xué)趨化因子等,其中與腦水腫關(guān)系最密切的包括IL-lβ?TNF-α?小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)參與炎癥反應(yīng)的主要免疫細(xì)胞[10],細(xì)胞因子在正常情況下不能通過(guò)BBB,但在腦損傷時(shí)BBB往往被破壞,同時(shí)細(xì)胞因子也可直接損害BBB,并且它還可通過(guò)飽和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)入腦內(nèi)[11]?TBI后早期,BBB通透性的增加是參與腦水腫形成的重要因素?炎性細(xì)胞因子可通過(guò)被破壞的BBB或直接破壞BBB,使其通透性增加,直接或間接作用于神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,誘發(fā)其分泌更多的細(xì)胞因子或使其表面表達(dá)更多的細(xì)胞因子受體,引起腦細(xì)胞腫脹,釋放各種神經(jīng)毒性因子(如氧自由基),從而加重BBB的破壞和細(xì)胞膜的損傷,產(chǎn)生和加重血管源性及細(xì)胞毒性腦水腫?

NF-κ B是由兩個(gè)蛋白亞基(p50和 p65)組成的二聚體,在胞漿中還有一種相對(duì)分子質(zhì)量為36 000～37 000的蛋白,對(duì)NF-κ B具有抑制作用,成為 I-κ B(inhibitory kappa B,I-κ B)?I-κ b與 NF-κ B結(jié)合成三聚體?有研究顯示 NF-κ B廣泛參與炎癥介質(zhì)和前炎癥介質(zhì)?黏附分子?趨化因子和一些炎性相關(guān)酶類等基因的調(diào)控[12]?正常時(shí),一般處于靜止?fàn)顟B(tài),當(dāng)受到某些理化刺激時(shí),通過(guò)特定的蛋白激酶,使 I-κ B磷酸化后降解,NF-κ B得以激活,NF-κ B活化后誘導(dǎo)多種炎性因子,進(jìn)而編碼相應(yīng)產(chǎn)物?在這些 NF-κ B的誘導(dǎo)物中,促炎因子 IL-1β和 TNF-α反過(guò)來(lái)又能直接刺激 NF-κ B,形成正反饋環(huán)?

本實(shí)驗(yàn)以小膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象?小膠質(zhì)細(xì)胞是定居腦內(nèi)的巨噬細(xì)胞,數(shù)量約占腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的4%～10%?最近的一項(xiàng)研究表明,神經(jīng)毒性物質(zhì),例如β-淀粉樣前體蛋白(βamyloid precursor protein,APP)通過(guò)募集酪氨酸激酶和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activeted protein kinase,MAPK)介導(dǎo)原代小膠質(zhì)細(xì)胞和一種單核細(xì)胞系的促炎癥激活[13]?據(jù)報(bào)道,直接損傷可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化?增生和肥大[14];由于活化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子,后者又進(jìn)一步刺激膠質(zhì)細(xì)胞增生,因此兩者形成一種惡性循環(huán)[15]?

本實(shí)驗(yàn)觀察到NF-κ B和AQP4的表達(dá)時(shí)相基本吻合,且表達(dá)高峰時(shí)相為傷后 1?3 d,這與臨床上TBI后腦水腫第一個(gè)高峰時(shí)相即傷后24 h是吻合的?推測(cè)NF-κ B這一核轉(zhuǎn)錄因子在傷后的表達(dá)促進(jìn)了AQP4的協(xié)調(diào)表達(dá),共同促進(jìn)TBI后腦水腫的發(fā)生?這一發(fā)現(xiàn),也為臨床通過(guò)抑制NF-κ B而減輕腦水腫提出了依據(jù),但仍需要做進(jìn)一步的基礎(chǔ)和臨床研究?

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The study of coordinate expression of NF-κ B and AQP4 on microglial cells postinjury

Zheng Chao,Wu Haitao,Sun Xiaochuan
(1.Department of Neurosurgery,theFirst People′s Hospital of Jiangbei District,Chongqing 400020,China;
2.Department of Neurosurgery,the First Af f iliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

ObjectiveTo investigate the coordinate expression of NF-κ B and AQP4 on microglial cells postinjury.MethodsMicroglial cells were removed from 1-day-old newborn rat the cultured in vitro,Mac-1 was identified with immunocytochemistry method.Cell injury model was constructed by scrarification.On the time point 12 h and 1,3,5,7 d after injury,the expression of NF-κ B mRNA was detected by RT-PCR.On the same time point the expression of AQP4 was detected with Western blot.Results12 h after injury,the expression of NF-κ B could hardly be observed.The maximal expression of NF-κ B was detected at 1 d postinjury.Afterwards,it declined gradually.The expression of AQP4 was analogous to NF-κ B.ConclusionThe expression of NF-κ B and AQP4 is of coordination,which indicats that traumatic inflammatory response contributes to cerebral edema posttrauma.

microglial;NF-kappa;Aquaproin4;coordinate expression

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.01.012

A

1671-8348(2011)01-0030-02

△通訊作者,電話:(023)89011151;E-mail:sunxch1445@gmail.com?

2010-01-14

2010-06-23)

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