蘇安平 田伯樂

·綜述與講座·

蛋白質(zhì)組學(xué)在胰腺癌早期診斷中的應(yīng)用

蘇安平 田伯樂

蛋白質(zhì)組學(xué)的提出及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展為胰腺癌的早期診斷奠定了基礎(chǔ)。其直接定位于蛋白質(zhì)水平，從整體、動(dòng)態(tài)、定量的角度研究基因功能，有助于發(fā)現(xiàn)用于早期臨床診斷的腫瘤標(biāo)志物，同時(shí)也可應(yīng)用于尋找新的治療靶標(biāo)和進(jìn)一步揭示胰腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。本文就近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)在胰腺癌早期診斷中的應(yīng)用做一概述。

一、蛋白質(zhì)組學(xué)及其相關(guān)技術(shù)

蛋白質(zhì)組(proteome)的概念源于蛋白質(zhì)與基因組兩個(gè)詞的雜合，指一個(gè)細(xì)胞、組織或有機(jī)體所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)則以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，研究整個(gè)基因組在不同時(shí)間、空間編碼的全部蛋白質(zhì)的組成及其相互作用[1]。具體包括三個(gè)方面[2]：(1)蛋白質(zhì)的大規(guī)模鑒定和翻譯后修飾的微特征研究；(2)差異表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)，即對(duì)多種疾病有廣泛應(yīng)用前景的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的比較；(3)應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)和酵母雙雜交體系研究各種蛋白質(zhì)間的相互作用。其中差異表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)在胰腺癌早期診斷中應(yīng)用廣泛。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究成功與否很大程度上取決于其技術(shù)水平的高低。蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要包括三大技術(shù)：(1)蛋白質(zhì)組分的分離技術(shù)；(2)蛋白質(zhì)組分的鑒定技術(shù)；(3)利用蛋白質(zhì)信息學(xué)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測(cè)技術(shù)。

1．蛋白質(zhì)組分的分離技術(shù)：目前，最常用的分離技術(shù)是雙向凝膠電泳(2-dimensional gel electrophoresis,2-DE)技術(shù)[3-6]。2-DE技術(shù)主要用于分離細(xì)胞或組織蛋白質(zhì)抽提物，構(gòu)建特定細(xì)胞或組織蛋白質(zhì)的二維電泳圖譜，分析特定條件下蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。由于具有高分辨率、高重復(fù)性、微量分析和制備等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中首選的分離技術(shù)[3]。除2-DE技術(shù)外，用于蛋白質(zhì)組分分離的技術(shù)還有親和層析、毛細(xì)管區(qū)帶電泳、反向高效液相色譜和多維色譜等[4]。

2．蛋白質(zhì)組分的鑒定技術(shù)：目前常用的鑒定技術(shù)是質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)鑒定技術(shù)。根據(jù)生物大分子離子化的方式不同，MS鑒定技術(shù)可以分為：基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和電噴霧離子化質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)。前者應(yīng)用激光使生物大分子離子化，得到酶解肽段的分子量，fingerprint,從而獲得蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide massPMF)，然后應(yīng)用適當(dāng)?shù)能浖褜さ鞍踪|(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的定性鑒定。后者則通過(guò)噴射過(guò)程中的電場(chǎng)進(jìn)行離子化，可以進(jìn)行肽的測(cè)序，得出肽段的氨基酸序列，從而獲得肽序列標(biāo)簽(peptide sequence tag, PST)[5]。根據(jù)部分氨基酸序列，結(jié)合此段氨基酸序列前后的離子質(zhì)量和肽段母離子的質(zhì)量，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中查尋，鑒定出相應(yīng)蛋白質(zhì)。MS鑒定技術(shù)還可應(yīng)用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)相互作用等研究領(lǐng)域。除MALDI-TOF-MS、ESI-MS外，許多新技術(shù)也開始應(yīng)用于蛋白質(zhì)的鑒定及相互作用的研究，如生物傳感芯片質(zhì)譜(biosensor chip mass spectrometry)[6]、蛋白質(zhì)芯片(protein chip)[7]、表面增強(qiáng)激光解吸離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)[8]、同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽(isotope coded-affinity tags，ICAT)技術(shù)[9]等。

3．蛋白質(zhì)組分的生物信息學(xué)：生物信息學(xué)(bioinformatics)就是利用計(jì)算機(jī)科學(xué)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)來(lái)解決生物學(xué)問題。在蛋白質(zhì)組學(xué)方面，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)所得到的高通量的研究結(jié)果需要強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理工具支持，因此生物信息學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可缺少的一部分。生物信息學(xué)可對(duì)其研究的內(nèi)容進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、儲(chǔ)存、管理、搜集和修復(fù)等處理。生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中有兩個(gè)重要應(yīng)用：(1)分析和構(gòu)建雙向凝膠電泳圖譜；(2)搜索與構(gòu)建蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。目前常用的數(shù)據(jù)庫(kù)有PSD、SWISS-PROT、PROSITE、PDB等[7,10-11]。

二、蛋白質(zhì)組學(xué)在胰腺癌早期診斷中的應(yīng)用

目前，已有學(xué)者應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從胰腺癌患者血漿、胰液和癌組織中尋找相關(guān)腫瘤標(biāo)志物，為胰腺癌的早期診斷提供理論支持。

1．胰腺癌血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究：由于血漿獲取方便且成本低廉，是蛋白質(zhì)組學(xué)在胰腺癌早期診斷研究中的理想樣本。但是由于血漿蛋白的復(fù)雜性，蛋白質(zhì)組學(xué)研究非常困難。Valerio等[12]使用MALDI-TOF-MS技術(shù)未能從胰腺癌患者血漿中鑒定出胰腺癌腫瘤特異性標(biāo)志物。近年來(lái)，隨著SELDI-TOF-MS等新技術(shù)的發(fā)展，血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的研究邁入一個(gè)新階段。Honda等[13]應(yīng)用表面增強(qiáng)激光解吸電離合并混合型四極時(shí)間飛行質(zhì)譜對(duì)245例血清樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)蛋白質(zhì)峰：m/z 8766、m/z 17272、m/z 28080和m/z 14779，四者聯(lián)合診斷的敏感性為97.2%，特異性為94.4%，若結(jié)合CA19-9，診斷符合率達(dá)100%。Koopmann等[14]利用SELDI-TOF-MS技術(shù)分析胰腺癌患者和正常人的血漿，鑒定出3種蛋白質(zhì)：PC-A、PC-B和CA19-9。這3種蛋白質(zhì)作為腫瘤特異性標(biāo)志物應(yīng)用于臨床檢測(cè)時(shí)，PC-A蛋白敏感性為83%，特異性為85%；PC-B蛋白敏感性為70%，特異性為85%；CA19-9蛋白敏感性為64%，特異性為85%。國(guó)內(nèi)學(xué)者付文廣等[15]采用SELDI-TOF-MS技術(shù)分析了23例胰腺癌、25例正常人和11例其他胰腺疾病(慢性胰腺炎7例、胰腺假性囊腫4例)血清標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)血清蛋白質(zhì)指紋圖譜中有44個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中m/z 2732 敏感性為91.30%，特異性為68.18%；m/z 9111 敏感性為52.17%，特異性為81.82%。

2．胰腺癌胰液蛋白質(zhì)組學(xué)研究：由于90%的胰腺癌為導(dǎo)管細(xì)胞腺癌，因此通過(guò)ERCP獲取的胰液標(biāo)本也富集由胰腺導(dǎo)管細(xì)胞所釋放的癌特異性蛋白[16]，這讓胰液檢測(cè)成為胰腺癌早期診斷的重要手段。Rosty等[17]利用SELDI-TOF-MS技術(shù)分析來(lái)自胰腺癌和其他胰腺疾病患者的胰液，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)蛋白質(zhì)峰并鑒定為肝癌-小腸-胰腺/胰腺炎相關(guān)蛋白I(hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancretitis-associated protein I,HIP/PAP-I)，其在胰腺癌胰液中的濃度顯著高于其他胰腺疾病。繼而采用ELISA檢測(cè)，證實(shí)HIP/PAP-I與胰腺癌密切相關(guān)，提示檢測(cè)胰液中的HIP/PAP-I可能有助于胰腺癌的早期診斷。Gronborg等[18]利用2-DE和LC-MS/MS技術(shù)對(duì)3例胰腺癌患者的胰液進(jìn)行分析，分別鑒定出73、61、115個(gè)蛋白質(zhì)。其中，23個(gè)蛋白質(zhì)同時(shí)存在于3例胰腺癌患者胰液中，并鑒定出一個(gè)新的蛋白質(zhì)，因其結(jié)構(gòu)與HIP/PAP-I類似，將其命名為PAP-2，這一蛋白質(zhì)可能成為胰腺癌早期診斷的腫瘤標(biāo)志物。Chen等[19]利用ICAT和LC-MS/MS技術(shù)分析胰腺癌患者和胰腺炎患者的胰液，鑒定出3種差異表達(dá)蛋白質(zhì)：纖維蛋白原B鏈、血漿纖維蛋白溶解酶/血漿纖維蛋白溶解酶原、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子L1。同時(shí)，Chen等[16]還用定量蛋白質(zhì)組的方法比較了胰腺癌患者和正常健康人胰液蛋白譜的差異。發(fā)現(xiàn)有30個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)均出現(xiàn)>2.0倍的表達(dá)差異。隨后應(yīng)用Western blotting對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果表明其在胰腺癌患者的胰液和組織中表達(dá)均增高。

3．胰腺癌組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究：在胰腺癌蛋白質(zhì)組研究中最常用的方法是直接檢測(cè)癌組織和正常對(duì)照組織。在癌組織樣本中，候選腫瘤標(biāo)志物可能具有較高濃度，并且有利于MS鑒定。癌組織篩選出來(lái)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，還可進(jìn)一步發(fā)展為血漿標(biāo)志物。Lu等[20]利用2-DE和MALDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)12例胰腺癌患者癌組織和癌旁組織進(jìn)行分析，成功鑒定出111種差異表達(dá)蛋白質(zhì)。其中，70種蛋白質(zhì)在癌組織中有較強(qiáng)表達(dá)(多數(shù)>2.0倍)，而在正常組織中只有41種較強(qiáng)表達(dá)。在70種較強(qiáng)表達(dá)蛋白質(zhì)中，兩種蛋白質(zhì)(fascin和cathepsin D)通過(guò)免疫組化得到證實(shí)。最重要的是fascin在21例胰腺癌患者癌組織中13例陽(yáng)性表達(dá)，而在正常胰腺組織中無(wú)一表達(dá)，且fascin的表達(dá)與胰腺癌的分化程度密切相關(guān)。Shen[21]等聯(lián)合應(yīng)用2-DE和MALDI-TOF-MS技術(shù)比較分析了6例胰腺癌組織、2例癌旁組織、7例胰腺炎組織和6例正常胰腺組織之間蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，鑒定出40種差異表達(dá)蛋白質(zhì)。其中7種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)經(jīng)Western blotting和免疫組化得到確認(rèn)，包括：a-烯醇酶(a-enolase)、組織蛋白酶D(cathepsin D)、鈣網(wǎng)織蛋白(calreticulin)、galectin-1、銅鋅超氧化物岐化酶(CuZnSOD)和錳超氧化物岐化酶(MnSOD)?；?0%～90%胰腺導(dǎo)管細(xì)胞腺癌細(xì)胞散布于成纖維細(xì)胞間質(zhì)中，Shekouh等[22]利用激光捕獲顯微切割(1aser-capture microdissection)技術(shù)分別切取4例胰腺癌患者癌組織、2例胰腺癌患者配對(duì)癌旁組織及2例正常人胰腺組織的導(dǎo)管上皮細(xì)胞，并進(jìn)行2-DE分離及MALDI-TOF-MS分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9種蛋白質(zhì)差異表達(dá)。其中5種在癌細(xì)胞中表達(dá)增加，4種表達(dá)減少。并鑒定出4種差異表達(dá)蛋白質(zhì)：S100A6、膜連蛋白III、乳酸脫氫酶和胰蛋白酶。其中，S100A6在胰腺癌組織中特異性的高表達(dá)得到了免疫組化染色的證實(shí)，同時(shí)研究表明S100A6與胰腺癌的分期密切相關(guān)。

三、蛋白質(zhì)組學(xué)的問題及應(yīng)用前景

蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，并已形成臨床蛋白質(zhì)組學(xué)分支。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略普遍被接受的同時(shí)，也應(yīng)該清醒地認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)現(xiàn)階段還不是一種完美的工具，在當(dāng)前技術(shù)條件的限制下，還有一些問題等待解決。例如如何解決不同的研究方法、研究對(duì)象(血漿、胰液和組織)、研究人數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；如何解決高豐度蛋白對(duì)低豐度蛋白的掩蓋；如何提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重復(fù)性[23]。要解決上述問題，對(duì)胰腺癌蛋白質(zhì)組學(xué)的研究應(yīng)考慮以下幾方面：(1)是否有足夠的研究人數(shù)；(2)是否根據(jù)WHO的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胰腺癌進(jìn)行組織學(xué)分類，是否對(duì)非腫瘤組織樣本進(jìn)行組織學(xué)描述；(3)是否根據(jù)年齡、性別和相關(guān)疾病選擇對(duì)照組；(4)如何識(shí)別蛋白峰；(5)是否通過(guò)ELISA、Western blotting或免疫組化對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定驗(yàn)證。盡管目前存在許多困難，但是隨著技術(shù)與方法的不斷創(chuàng)新與發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)必將在胰腺癌的早期診斷中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

[1] Blackstock WP,Weir MP.Proteomics:quantitative and physical mapping of cellular proteins.Trends Biotechnol,1999,17:121-127.

[2] Pandey A,Mann M.Proteomics to study genes and genomes.Nature,2000, 405:837-846.

[3] Gorg A,Weiss W,Dunn MJ.Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.Proteomics,2004,4:3665-3685.

[4] Issaq HJ,Chan KC,Janini GM,et al.Multidimensional separation of peptides for effective proteomic analysis.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2005,817:35-47.

[5] 徐建華,任麗楠.蛋白質(zhì)組學(xué)及其在胰腺癌中的研究進(jìn)展.胰腺病學(xué),2005,5:123-124.

[6] Seong SY. Microimmunoassay using a protein chip: optimizing conditions for protein immobilization.Clin Diagn Lab Immunol,2002,9:927-930.

[7] Boguski MS,Mclntosh MW.Biomedical informatics for proteomics. Nature,2003,422 :233-237.

[8] Tang N,Tornatore P,Weinberger SR.Current developments in SELDI affinity technology.Mass Spectrom Rev,2004,23:34-44.

[9] Ong SE,Mann M.Mass spectrometry-based proteomics turns quantitative.Nat Chem Biol,2005,1:252-262.

[10] Mann M,Hendrickson RC,Pandey A.Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry.Annu Rev Biochem,2001,70:437-473.

[11] Binz PA,Muller M,Hoogland C,et al.The molecular scanner: concept and developments.Curr Opin Biotechnol,2004,15:17-23.

[12] Valerio A,Basso D,Mazza S,et al.Serum protein profiles of patients with pancreatic cancer and chronic pancreatitis:searching for a diagnostic protein pattern.Rapid Commun Mass Spectrom,2001,15:2420-2425.

[13] Honda K,Hayashida Y,Umaki T,et al.Possible detection of pancreatic cancer by plasma protein profiling.Cancer Res,2005,65:10613-10622.

[14] Koopmann J,Zhang Z, White N, et al.Serum diagnosis of pancreatic adenocarcinoma using sulface-enhanced laser desorption and ionization mass spectrometry.C1in Cancer Res,2004,10:860-868.

[15] 付文廣,雷正明,王開正等.胰腺癌血清蛋白組學(xué)的研究.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2009,19:2728-2732.

[16] Chen R,Pan S,Yi EC,et al.Quantitative proteomic profiling of pancreatic cancer juice.Proteomics,2006,6:3871-3879.

[17] Rosty C,Christa L,Kuzdzal S,et al.Identification of hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancretitis-associated protein I as a biomarker for pancreatic ductal adenocarcinoma by protein biochip technology.Cancer Res,2002,62:1868-1875.

[18] Gronborg M,Bunkenborg J,Kristiansen TZ,et al.Comprehensive proteomic analysis of human pancreatic juice.J Proteome Res,2004,3:1042-1055.

[19] Chen R,Pan S,Cooke K,et al.Comparison of pancreas juice proteins from cancer versus pancreatitis using quantitative proteomic analysis.Pancreas, 2007,34:70-79.

[20] Lu Z,Hu L,Evers S,et al.Differential expression profiling of human pancreatic adenocarcinoma and healthy pancreatic tissue.Proteomics,2004,4:3975-3988.

[21] Shen J,Person MD,Zhu J,et al.Protein expression profiles in pancreatic adenocarcinoma compared with normal pancreatic tissue and tissue affected by pancreatitis as detected by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.Cancer Res,2004,64:9018-9026.

[22] Shekouh AR,Thompson CC,Prime W,et al.Application of laser capture microdissection combined with two-dimensional electrophoresis for the discovery of differentially regulated proteins in pancreatic ductal adenocarcinoma.Proteomics,2003,3:1988-2001.

[23] Mora JF,Van Berkel GJ,Enke CG,et al.Electrochemical processes in electrospray ionization mass spectrometry.J Mass Spectrom,2000,35:939-952.

2010-04-12)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.027

610041 四川成都，四川大學(xué)華西醫(yī)院肝膽胰外科

田伯樂，Email：bo-le@medmail.com.cn