王宇歆，劉洪斌，李東華

中藥研究手段的現(xiàn)代化是中藥現(xiàn)代化最重要的組成部分，其中包括用現(xiàn)代科技手段對中藥有效成分確定，中藥的生產(chǎn)和質(zhì)量控制，以及中藥代謝過程確定等一系列的問題。其中高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(high performance liquid chromatograph-mass spectrometer，HPLC-MS)將色譜的分離能力與高分辨光譜的表征能力相結(jié)合，不僅具有色譜的高效、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好、操作方便、使用范圍廣等優(yōu)點，同時具有定性、定量能力強的特點，非常適合活性成分復(fù)雜、含量低的植物藥研究，為中藥中有效成分的定性、定量及中藥代謝等問題的解決提供了強有力的工具和手段[1]。

1 質(zhì)譜技術(shù)簡介

質(zhì)譜儀器一般由真空系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器和計算機控制與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成[2]，質(zhì)譜儀需要在高真空下工作:⑴大量氧會燒壞離子源的燈絲；⑵用作加速離子的幾千伏高壓會引起放電；⑶引起額外的離子-分子反應(yīng)，改變裂解模型，譜圖復(fù)雜化。

目前常用的高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用具有兩大分類系統(tǒng)，一種是從質(zhì)譜的離子源角度來劃分，包括電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)、大氣壓化學(xué)電離源(atmospheric pressure chemical ionization，APCI)、大氣壓光電離源(atmosphere pressure Interface，APPI)和基質(zhì)輔助激光解析電離源(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)等[3]；另一種是從質(zhì)譜的質(zhì)量分析器角度來劃分，包括四極桿、離子阱、飛行時間(Time-of-Flight，TOF)和傅立葉變換質(zhì)譜等[4]。

從離子源角度來看，ESI適合于中高極性的化合物，特別適合于反相液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，是目前液質(zhì)聯(lián)用中應(yīng)用最廣泛的一種離子化方式，ESI-MS的優(yōu)點還在于它是一種濃度型檢測器，因此可以不受樣品量的限制，近幾年發(fā)展起來的微噴霧和納噴霧技術(shù)尤其適合微量樣品的高靈敏度分析[5]。APCI采用電暈放電來電離氣相的分析物，因此要求被分析物具有一定的揮發(fā)性，它最適合于中、低極性的中等分子量化合物，不易形成多電荷，譜圖解析相對簡單[6]。APPI是在大氣壓下利用光化作用將氣相的被分析物離子化的技術(shù)，其適應(yīng)范圍與APCI相似，是對APCI的補充[3]。MALDI則是將樣品加入到一種能夠強烈吸收入射激光的基質(zhì)中，通過能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生樣品的分子離子或準(zhǔn)分子離子，其優(yōu)點在于容易與TOF聯(lián)用測定高質(zhì)量數(shù)的分子，其靈敏度高，樣品制備較簡單，現(xiàn)己被廣泛應(yīng)于分析蛋白質(zhì)、肽類、核苷酸、多糖以及合成聚合物等。但由于MALDI自身的特點，目前直接在線與HPLC聯(lián)用的應(yīng)用研究還相對較少[7]。

從質(zhì)量分析器角度來看，四極桿是在交變電場的作用下，使某些符合要求的離子通過四極桿到達檢測器，三級四極桿質(zhì)譜則可以實現(xiàn)二級質(zhì)譜功能[8]。離子阱則是首先把離子聚集到阱內(nèi)，通過改變電參數(shù)把阱內(nèi)離子逐個釋放到達檢測器，離子阱質(zhì)譜具有多級質(zhì)譜功能，對于解析化合物結(jié)構(gòu)更為有利，但是質(zhì)量準(zhǔn)確度和分辨率不及四極桿質(zhì)量分析器。對于一級質(zhì)譜選擇離子檢測或串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測時，四極桿質(zhì)量分析器的靈敏度一般比離子阱高1～2個數(shù)量級，因此更適用于微量或痕量成分的定量分析[9]。飛行時間質(zhì)譜是應(yīng)用不同m/z離子的飛行速度不同，離子飛行通過相同的路徑到達檢測器的時間不同而獲得質(zhì)量分離，它常與MALDI聯(lián)用，優(yōu)點是掃描速度快、分析的質(zhì)量范圍寬，質(zhì)量測定精確[10]。

2 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在中藥研究進展

2.1 中藥成分分析 隨著人們對藥用植物成分的廣泛深入的研究，對已知化合物的研究，在有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，可利用液質(zhì)聯(lián)用，將樣品組分的保留時間、分子量信息與標(biāo)準(zhǔn)品相比較，從而快速鑒定已知化學(xué)成分；在無現(xiàn)成標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，可以根據(jù)樣品組分的分子量信息，特別是由串聯(lián)質(zhì)譜得到的特征碎片離子或中性丟失等結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合相關(guān)文獻報道，從而進行快速鑒定[11]。例如，Li等[12]利用液質(zhì)聯(lián)用，通過對比標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間、質(zhì)譜分子量信息等對黃柏皮層中10種化學(xué)成分進行了快速鑒定。Zhang等[13]采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對白芷提取物的化學(xué)成分進行分析，在30min內(nèi)初步鑒定了23種呋喃駢香豆精。

液質(zhì)聯(lián)用不僅可以快速鑒定中藥中的已知化學(xué)成分，而且能快速鑒定未知化學(xué)成分。由于中藥提取物中的同類化合物在化學(xué)結(jié)構(gòu)很相似，因此可以對數(shù)個已知單體化合物進行質(zhì)譜裂解分析，研究這一類化合物的裂解特征以及結(jié)構(gòu)上的細微差異引起的裂解行為的不同，總結(jié)出基于結(jié)構(gòu)特征的質(zhì)譜碎裂規(guī)律，然后利用這個規(guī)律，根據(jù)這類化合物未知成分的質(zhì)譜裂解特征直接推斷其化學(xué)結(jié)構(gòu)[14]。例如，Petsalo等[15]利用類黃酮化合物在負離子模式下，糖苷取代基位置的不同引起質(zhì)譜碎裂產(chǎn)生的糖苷配基奇電子離子的相對豐度不同的規(guī)律，對紅景天提取物進行液質(zhì)聯(lián)用分析，直接快速鑒定了其中的15種化合物，其中10個含量較少的化合物為首次從該植物中報道。Grayer等[16]從9種羅勒屬植物中檢測到了23種黃酮類化合物。其中15種組分通過對比標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC保留時間以及質(zhì)譜分子量信息得到直接確定，根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律確定了1種新化學(xué)物。

因此，液質(zhì)聯(lián)用可以快速鑒定中藥的已知或未知化學(xué)成分，對已知化合物，可以避免重復(fù)工作，對未知化合物，特別是其中感興趣的微量活性成分，可以進行靶裂解，從而有效地指導(dǎo)選擇性分離提取實驗，加快發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的分析速度。

2.2 中藥質(zhì)量控制 目前，現(xiàn)行的中藥質(zhì)量控制方法主要是對一些有效成分或特征性成分進行定性及定量分析，然而中藥特有的多成分、多靶點作用模式?jīng)Q定了其藥效并非是某幾個“指標(biāo)成分”或“主要成分”在起作用，而是多種成分共同作用的結(jié)果。中藥指紋圖譜分析是對中藥及其制劑進行綜合宏觀分析的可行手段，能夠全面反映中藥內(nèi)在化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進而反映中藥的質(zhì)量[11]。目前，國家食品藥品監(jiān)督管理局要求制造商對中藥注射液及其原料應(yīng)用指紋圖譜進行質(zhì)控。這也促進了HPLC-MS技術(shù)在中藥質(zhì)控方面的發(fā)展。

HPLC-MS技術(shù)與常用的液相-紫外技術(shù)相比，可以提供色譜峰相對分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息，根據(jù)斷裂的片段以及文獻報道推測可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)，體現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢。

Song等[17]利用HPLC-MSn技術(shù)，建立了銀杏葉提取物的多維指紋圖譜，可同時得到各個成分的保留時間、線紫外光譜圖、一級質(zhì)譜圖(各個成分的相對分子質(zhì)量)和二級質(zhì)譜圖(某成分的特征碎片)，使同時檢測銀杏葉中兩類有效成分——黃酮和內(nèi)酯類化合物成為可能。研究采用電噴霧離子源，負離子檢測模式下，采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用指紋圖譜相似度計算軟件，考察了15個產(chǎn)地的銀杏葉提取物與正宗銀杏提取物的相似度。HPLC-MS用于質(zhì)量控制的研究，不僅僅是在指紋圖譜中應(yīng)用，最有意義的是對中藥材、天然藥材及成藥中含量低，沒有紫外吸收線或紫外響應(yīng)值低的化合物，尤其是毒性成分進行含量測定。HPLC-MS技術(shù)分析樣品不需要進行繁瑣和復(fù)雜的前處理，同時得到化合物的保留時間、相對分子質(zhì)量及特征結(jié)構(gòu)碎片等豐富的信息，具有高效快速和高靈敏度的特點，尤其適用于含量少、無特征紫外吸收官能團的分析檢測。

2.3 中藥藥物代謝動力學(xué)分析 藥物代謝過程包括藥物分子在生物系統(tǒng)中的吸收、分布、代謝及排泄，這些因素決定了藥物能否以適當(dāng)濃度到達目標(biāo)部位，并停留一定時間，從而使藥物的療效得以發(fā)揮。HPLC-MS在藥物代謝研究中除了可確定分子量之外，還可以根據(jù)特異性斷裂規(guī)律推導(dǎo)出重要部分結(jié)構(gòu)甚至是完整的結(jié)構(gòu)。其根據(jù)是由于多數(shù)藥物的代謝物保留了原形藥物分子的骨架結(jié)構(gòu)，因此，代謝物可能與母體藥物具有相似的裂解規(guī)律，即失去一些相同的中性碎片或形成一些相同的特征離子，利用HPLC-MS可以迅速找到可能的代謝物，并鑒定出結(jié)構(gòu)。

Cheng等人[18]對最常用中草藥甘草進行了代謝組學(xué)研究，應(yīng)用HPLC-MS確定了大鼠口服臨床劑量甘草代謝物中42種血漿代謝物和62種尿代謝物，這是完全依照臨床劑量進行的中草藥代謝組學(xué)研究。目前,應(yīng)用LC-MS進行快速高通量的代謝組學(xué)研究已成為中藥藥代動力學(xué)研究的熱點。Xin等[19]成功建立了HPLC-MS快速測定浙貝母灌胃后大鼠血漿中貝母素、貝母酮和異貝母堿含量的方法，用于中藥藥代動力學(xué)研究，此方法在0.505～96.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.999）。對于復(fù)方的代謝組學(xué)研究也是LC-MS的研究趨勢。Su等[20]報道應(yīng)用UPLC-MS鑒定了口服少腹逐瘀湯大鼠的血漿，共鑒定16個峰，其中12個峰與標(biāo)準(zhǔn)品進行了對照，另外通過據(jù)斷裂的片段以及文獻報道推測了9種代謝物。

3 展望

中醫(yī)藥學(xué)是祖國醫(yī)學(xué)幾千年臨床經(jīng)驗的結(jié)晶，是我國醫(yī)學(xué)的瑰寶，但是中藥活性成分復(fù)雜、代謝物在生物樣品中濃度較低，且生物樣品內(nèi)源性雜質(zhì)較多，給中藥研究帶來了相當(dāng)大的困難。利用HPLC-MS等現(xiàn)代的分析手段是中藥現(xiàn)代化、國際化的必然要求。HPLC-MS技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的快速篩選、中藥材鑒別、質(zhì)量控制、代謝機理和動力學(xué)以及配伍規(guī)律研究等領(lǐng)域。HPLC-MS技術(shù)具有的高分離、高靈敏度、高選擇性以及能提供豐富結(jié)構(gòu)信息等一系列優(yōu)點，可有效地對中藥成分進行整體分析。因此HPLC-MS再加上氣相色譜法-質(zhì)譜和高效液相色譜-核磁譜等聯(lián)用技術(shù)的補充，將會使中醫(yī)藥學(xué)研究上升到更高水平。

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