劉亞光，方正之，姚文兵

(中國藥科大學 生命科學與技術(shù)學院，江蘇 南京 210009)

遺傳密碼擴充技術(shù)在蛋白質(zhì)研究中的應用進展

劉亞光，方正之，姚文兵

(中國藥科大學 生命科學與技術(shù)學院，江蘇 南京 210009)

生命科學發(fā)展需要獲得進化的蛋白質(zhì)來滿足科學研究的需要，在蛋白質(zhì)中引入非天然氨基酸從而賦予其更多的功能成為蛋白質(zhì)進化的一個重要手段。一項遺傳密碼擴充技術(shù)很好的實現(xiàn)了在體內(nèi)定點引入非天然氨基酸，這項技術(shù)的關(guān)鍵是獲得一對正交的氨酰tRNA合成酶/tRNA分子對，利用其高特異性反應將非天然氨基酸定點引入蛋白質(zhì)分子中。迄今為止，幾十種非天然氨基酸通過此方法被中引入到蛋白質(zhì)中，從而打開了蛋白質(zhì)研究的新天地。本文介紹了這項技術(shù)的基本原理，并對其在蛋白質(zhì)修飾、結(jié)構(gòu)和功能研究、以及在藥用蛋白中的應用進展進行了綜述。

蛋白質(zhì)進化;非天然氨基酸;定點引入;遺傳密碼擴充;氨酰tRNA合成酶/tRNA分子對

生物體內(nèi)所有蛋白質(zhì)都是由三聯(lián)密碼子編碼的20種天然氨基酸所組成的，這些天然的氨基酸只含有一些有限的功能基團如羥基、羧基、氨基、烷基和芳香基團等。隨著生命科學的發(fā)展，通過翻譯后修飾的研究以及“第21種氨基酸”硒代半胱氨酸和“第22種氨基酸”吡咯賴氨酸的發(fā)現(xiàn)及應用，可以賦予蛋白質(zhì)一些新的生物學功能［1－2］。然而隨著現(xiàn)代科學的發(fā)展，天然蛋白質(zhì)已無法滿足人們對于蛋白質(zhì)更深層研究的需求，所以必須尋求一種系統(tǒng)擴展遺傳密碼的方法使蛋白質(zhì)乃至整個生物體得以進化，從而賦予蛋白質(zhì)新的物理、化學或生物學特性，便于人們更好的操控蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。

目前，蛋白質(zhì)的制備方法主要有3種:生化提取法、基因工程法和化學合成法，但由于其各自的局限性無法獲得滿意的蛋白質(zhì)突變體［3－5］。近年來，由美國 Scripps實驗室的 Peter博士領(lǐng)導的團隊報道了一種可以在生物體內(nèi)編碼合成含有UAA蛋白質(zhì)的方法－遺傳密碼擴充技術(shù)，為蛋白質(zhì)進化提供了新的思路［6］。

1 遺傳密碼擴充技術(shù)的原理

利用該技術(shù)在生物體內(nèi)表達含有UAA的蛋白質(zhì)需要包括一些新的作用元件:特異性對應UAA的密碼子(unique codon)、特異性識別上述密碼子的新 tRNA(suppressor tRNA)及其對應的氨酰tRNA合成酶(aminoacyl－tRNA synthetase，aaRS)，這些元件在蛋白質(zhì)翻譯過程中必須保證正交性從而使UAA被引入到蛋白質(zhì)的特定位置上。

新的aaRS必須只識別對應的新tRNA而不能識別宿主菌內(nèi)任何內(nèi)源性tRNA;新tRNA必須特異性識別UAA對應的密碼子而且不能被內(nèi)源性aaRS氨?；?并且UAA和其對應的aaRS必須與天然氨基酸和其對應的內(nèi)源性合成酶沒有交聯(lián)反應。換言之，這種新aaRS只能催化相應的新tRNA與UAA的氨?；磻?，否則非天然的和天然的氨基酸都會被引入到蛋白質(zhì)特定位點上而導致特異性降低［7］;另外，UAA不能是任何內(nèi)源性合成酶的底物，否則局部的UAA取代將會遍布整個蛋白質(zhì)組。

通過遺傳密碼擴充技術(shù)，可以在大腸桿菌［8］、酵母［9］和哺乳動物細胞［10］中直接編碼UAA，通過特定的密碼子，已有數(shù)十種UAA被引入至蛋白質(zhì)中［11］，這些氨基酸攜帶許多特殊功能基團，為蛋白質(zhì)活性與結(jié)構(gòu)的研究提供了廣闊平臺。

2 遺傳密碼擴充技術(shù)的應用

經(jīng)由以上篩選機制得到的正交氨酰tRNA合成酶/tRNA系統(tǒng)已經(jīng)將約70種的UAA特異性的引入至蛋白質(zhì)中，這些UAA因其擁有廣泛的性質(zhì)被形象的稱為“化學工具箱”，可以幫助我們深入研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，以及賦予蛋白質(zhì)更多更新更好的功能。

2.1 UAA引入用于蛋白質(zhì)定點修飾

目前在蛋白質(zhì)中天然氨基酸殘基上的修飾往往會形成多修飾產(chǎn)物，在體內(nèi)引入一些含有特殊側(cè)鏈的UAA則可以通過與特定修飾劑的特異性反應而實現(xiàn)定點修飾。炔基與疊氮基團可以經(jīng)由［3+2］環(huán)加成反應而形成三唑化合物，在蛋白質(zhì)中定點引入含有二者之一的UAA可實現(xiàn)在此位點上被含有另一種基團的修飾劑所修飾。在肌紅蛋白的第四位引入對炔丙氧基苯丙氨酸后，在以Cu2+離子做催化劑的堿性(pH 8.0)條件下和相應含疊氮基的修飾劑反應，可以使蛋白在特定位點分別帶上單?；蜔晒饣鶊F，這兩個基團分別在360和450 nm波長的紫外光照射下發(fā)光，起到標簽的作用［12－13］。

酮基是有機化學中一類重要的功能性基團，而生物體內(nèi)編碼的天然氨基酸卻沒有包含酮基，在蛋白質(zhì)中定點引入含酮基的UAA，可以有效突破一些天然蛋白質(zhì)合成帶來的限制。酮基在水溶液中、溫和條件下可以與酰肼、羥胺和氨基脲反應分別生成相應基團，將對乙酰基苯丙氨酸定點引入Z－domain蛋白后，分別用熒光素酰肼和生物素酰肼對其進行反應，帶有熒光素的蛋白在490 nm波長下顯出熒光，而帶有生物素的蛋白質(zhì)經(jīng)Western blot檢測出條帶［14］。酮基的定點修飾還可以用于測定分子間距離以分析蛋白結(jié)構(gòu)，在T4溶菌酶的第72位引入對乙酰苯丙氨酸，并將其第157位突變?yōu)榘腚装彼?，分別用兩種修飾劑Alexa488－烷氧基胺和Alexa594－馬來酰亞胺與上述兩個基團進行反應形成蛋白的雙標記，再運用單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)測定供體和受體的分子距離，測定結(jié)果為34?，與理論值一致［15］。我們可以利用溫和方便的反應條件在酮基上嘗試更多的修飾劑比如多糖、脂肪酸、寡核苷酸、多肽等，現(xiàn)在已經(jīng)利用此反應對一些藥用蛋白進行PEG修飾，PEG酰肼修飾的含對乙酰苯丙氨酸的人生長激素顯示了增強的藥理學功能，其研究已經(jīng)進入了臨床階段。

由于硼酸在水溶液中生理pH值條件下可以與多羥基化合物發(fā)生可逆反應，而且比如硼酸鹽和山梨醇以及葡萄糖胺的相互作用具有高親和性，所以可以利用這個特點進行蛋白質(zhì)的純化。將Z－domain蛋白的第7位酪氨酸突變?yōu)門AG后定點引入對二羥硼基苯丙氨酸，再在室溫，pH 8.5的條件下與N－甲基葡萄糖胺樹脂結(jié)合，用高鹽洗脫雜蛋白后再用過量山梨醇洗脫可以得到純度很高的目的蛋白質(zhì)(甚至高于鎳親和柱純化的產(chǎn)物)，而二羥硼基具有可逆性的氧化還原反應，使超過95%的蛋白最終恢復為天然蛋白質(zhì)(對二羥硼基苯丙氨酸經(jīng)氧化反應可變?yōu)槔野彼?。此類修飾可用于蛋白質(zhì)的高純度“無痕”純化［16］。

2.2 UAA引入作為蛋白質(zhì)探針

一些具有光化學活性的UAA可被用作探針在體外和體內(nèi)的蛋白質(zhì)功能研究中發(fā)揮作用:

將蛋白質(zhì)“光籠”化可以實現(xiàn)用光來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性。這種“光籠”化的蛋白質(zhì)是一種被“光籠”基團修飾的蛋白質(zhì)，引入了“光籠”基團后蛋白質(zhì)的活性通常會減弱甚至喪失，而脫“光籠”化后能夠恢復蛋白質(zhì)的活性?！肮饣\”基團易于除去，在365 nm波長光照下即可脫“光籠”化，這樣通過光解反應可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在活性和非活性形式之間轉(zhuǎn)變。最常用的“光籠”基團包括偶氮苯基和硝基芐基，它們可以和羥基、羧基、巰基反應，因此半胱氨酸、絲氨酸、賴氨酸、色氨酸都可以通過化學合成帶上“光籠”基團。許多生物活性過程都可以因“光籠”化及脫“光籠”化帶來的酶或受體的活性改變，離子通道的變化，胞內(nèi)各種信號分子濃度的調(diào)節(jié)而得到瞬時瞬間的調(diào)控。通過一套改造了的Mj TyrRS/Mj tR－系統(tǒng)，可以實現(xiàn)在大腸桿菌體內(nèi)將β－半乳糖苷酶的活性位點第503位酪氨酸替換為鄰硝基芐酪氨酸。通過分別在體內(nèi)和體外對β－半乳糖苷酶突變體的活性進行測定，結(jié)果證明了在活細胞體內(nèi)以及體外都可對酶進行“光籠”化及脫“光籠”化，且對酶活性影響顯著，作用穩(wěn)定［17］。

利用特殊基團光致異構(gòu)化的性質(zhì)可以實現(xiàn)體內(nèi)和體外監(jiān)測一系列生物學過程。偶氮苯具有可轉(zhuǎn)化的順式和反式兩種光學異構(gòu)體，并且這兩種異構(gòu)體可經(jīng)光致異構(gòu)化，即當以320～340 nm波長光照射時，熱力學穩(wěn)定的反式異構(gòu)體轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖疆悩?gòu)體，當大于420 nm波長光照射時順式回復成為反式。由于這兩種異構(gòu)體的空間構(gòu)象和偶極性不同，導致了含有不同異構(gòu)體的蛋白質(zhì)活性有差別。在大腸桿菌中將偶氮苯苯丙氨酸引入到分解代謝物基因激活蛋白CAP中，通過鎳柱純化得到突變CAP，產(chǎn)量可達1.5 mg/L。通過紫外－可見光譜測定蛋白質(zhì)的吸收峰，并經(jīng)光致異構(gòu)化后測定蛋白質(zhì)吸收峰的波長改變，結(jié)果驗證了偶氮苯苯丙氨酸的高保真引入及可逆光致異構(gòu)化成功發(fā)生。偶氮苯化的CAP由于其順式和反式活性的差別，造成了與DNA親和能力的差別，從而調(diào)節(jié)了轉(zhuǎn)錄過程［18］。

含有光致交聯(lián)性質(zhì)基團的氨基酸可用于配體－受體相互作用的研究。例如對苯甲酰苯丙氨酸，經(jīng)350～365 nm波長光照射30 min激發(fā)后，其上的苯甲酮基團能與附近的C－H共價反應。在中國倉鼠卵細胞中，設(shè)計了一對正交分子對，其中的氨酰tRNA合成酶是Ec TyrRS的突變體，抑制型tRNA是嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的tRNATyr。將對苯甲酰苯丙氨酸引入到生長因子受體連接蛋白－2的受體結(jié)合口袋處的SH2區(qū)域。引入了pBpa的Grb2蛋白突變體在365 nm波長光照射下可與表皮生長因子交聯(lián)，也可與內(nèi)源性蛋白重組人酪氨酸激酶ErbB2發(fā)生交聯(lián)反應，從而實現(xiàn)在哺乳動物細胞內(nèi)研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用［19］。

2.3 UAA引入用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究

具有特殊譜學性質(zhì)的UAA可以幫助我們更好的研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。比如在體內(nèi)將同位素標記的UAA引入大分子蛋白質(zhì)中可以有效地減小其核磁共振譜的復雜性。在人脂肪酸合酶硫酯酶區(qū)域活性位點附近的11個位點上分別引入三氟氧苯丙氨酸，13C－和15N－標記的對甲氧基苯丙氨酸，和15N－標記的間硝基酪氨酸，再分別經(jīng)過1H－15N HSQC，1H－13C HSQC，和19FNMR測定不同的單個位點突變造成的化學位移，可以用于確定配體的結(jié)合位點以及配體結(jié)合在這些位點上形成的構(gòu)象改變［20］。

除了被用于定點修飾，疊氮基團還是一種應用廣泛的光致交聯(lián)劑，在紅外光譜上疊氮基團會在大約2 100 cm－1位置出現(xiàn)一個明顯的伸縮振動峰，利用這一性質(zhì)，先在G蛋白偶聯(lián)受體視紫質(zhì)中定點引入對疊氮基苯丙氨酸，再將其表達并重構(gòu)進脂膜內(nèi)，通過傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜檢測在光介導受體激活作用下疊氮基團伸縮頻率的改變，可以揭示特定氨基酸對蛋白自身環(huán)境改變的影響［21］。

利用遺傳密碼擴充技術(shù)將核糖核苷酸還原酶的α2亞基的第730位和731位酪氨酸分別替換成3－氨基酪氨酸NH2Y，得到的突 變 體 Y730NH2Y－α2 和 Y731NH2Y－α2 在RNRβ2亞基、CDP和ATP存在的條件下經(jīng)紫外－可見光譜和電子順磁共振光譜檢測，其結(jié)果解釋了RNR的兩個亞基結(jié)合時電子轉(zhuǎn)移的機制［22］。

將含有環(huán)境敏感熒光基團的UAA引入蛋白質(zhì)中有利于我們在體內(nèi)和體外對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進行研究。比如在肌紅蛋白中定點引入羥基香豆素衍生物可以作為檢測蛋白質(zhì)本地展開的探針［23］;將氟硅酸鈉衍生物引入谷氨酸結(jié)合蛋白可以用于檢測蛋白與配體結(jié)合后帶來的結(jié)構(gòu)改變［24］。

2.4 翻譯后修飾的UAA的引入

許多翻譯后修飾的氨基酸，例如磷酸化、磺化、甲基化、乙?；?、羥基化、硝基化的氨基酸可被定點引入到蛋白質(zhì)中，從而改變蛋白質(zhì)的生物學活性，改變多肽鏈的骨架進而影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在大腸桿菌中用改造了的Mj TyrRS/tRNA對將對羧甲基－L苯丙氨酸pCMF引入到人信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子－1 STAT1中，pCMF是磷酸酪氨酸pTyr的類似物。STAT1蛋白質(zhì)上第701位Tyr的磷酸化可以導致STAT1與DNA的緊密結(jié)合從而發(fā)揮其生物學活性，通過測定pCMF突變體與DNA的結(jié)合能力，結(jié)果顯示引入了pCMF的STAT1突變體與天然磷酸化的蛋白質(zhì)具有相同的DNA親和力。pCMF的引入可以賦予蛋白質(zhì)抵抗酪氨酸磷酸酶水解的能力，從而提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。通過這種方法實現(xiàn)了在原核生物體內(nèi)無法完成的磷酸化等翻譯后修飾，為制備信號轉(zhuǎn)導通路中一系列磷蛋白的穩(wěn)定體提供了可能性［25］。

在大腸桿菌中表達了將第9位賴氨酸取代為苯基硒代半胱氨酸PhSeCys的爪蟾組蛋白H3，接著將PhSeCys通過邁克爾加成反應生成乙?；嚢彼岷图谆嚢彼幔瑥亩鴮崿F(xiàn)了組蛋白的賴氨酸甲基化和乙?；揎?，這為研究賴氨酸調(diào)控的組蛋白的生物化學機制打下了基礎(chǔ)［26］。

2.5 在治療性蛋白質(zhì)中引入UAA

由于需要大量的同源修飾的蛋白質(zhì)分子用于治療目的，科學家們也已經(jīng)開始嘗試將遺傳密碼擴充技術(shù)應用于治療性蛋白的研究中。目前這類研究有三個熱點方向:其一是利用具有有免疫原性的氨基酸來阻斷免疫耐受并生成可用于治療癌癥和炎癥的疫苗，將對硝基苯丙氨酸引至目的蛋白的抗原表位可以延長其壽命，并產(chǎn)生可以與天然蛋白質(zhì)有交聯(lián)作用的抗體。比如將小鼠TNF－α的第11或86位氨基酸替換成對硝基苯丙氨酸所形成的新抗體可以與小鼠體內(nèi)天然的TNF－α產(chǎn)生交聯(lián)作用從而防止脂多糖介導的死亡的發(fā)生［27－28］。在T細胞的抗原表位引入對硝基苯丙氨酸可以激活B細胞自身反應生成與自身蛋白對應的多抗，這一原理可以應用在許多需要強免疫應答的抗原和抗原表位上。此類方法正在被應用在其他自身抗原上，比如與癌癥相關(guān)的EGF及其受體HER2，與心血管疾病相關(guān)的前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素PCSK9，與炎癥相關(guān)的過敏霉素C5a，以及人免疫缺陷病毒HIV的保守抗原表位和普通疫苗難以定位的瘧疾等。

其次是生成抗凝血蛋白磺基水蛭素，水蛭素是臨床應用最有效的天然抗凝血劑，然而由于機體內(nèi)缺乏必需的硫基轉(zhuǎn)移酶，在大腸桿菌和酵母體內(nèi)重組表達的水蛭素都是非磺化。研究表明將第63位酪氨酸磺化后的水蛭素與人凝血酶的親和力比非磺化水蛭素增加了10倍，磺化水蛭素比其非磺化形式顯示出更好地臨床應用前景［29］。

第三個方向是得到一系列蛋白軛合物，使它們的特定位點含有如毒素、放射性同位素、聚乙二醇、甚至另一種蛋白質(zhì)(以實現(xiàn)雙治療功能)。要實現(xiàn)這一目的就要定點引入一個包含UAA的生物正交反應功能基團，這個基團隨后在體外被其他小分子或大分子官能化，這一方法可以有效克服常規(guī)親電子試劑的非特異性標記和半胱氨酸殘基標記的非特異性或殘基參與蛋白折疊的困難。在非治療性蛋白的研究中，這個方法被普遍應用于多糖和脂類連接［13，30］，用熒光基團標記 G 蛋白偶聯(lián)受體［31］，非天然組蛋白修飾［32］，和蛋白質(zhì)的無痕純化［16］。在治療性蛋白的研究中，這個方法在生成具有特定藥理學活性和毒性的同源治療劑方面應用前景很廣泛。而且由于UAA是在蛋白質(zhì)翻譯過程中被同時引入的，具有很高的效率，可以直接生成臨床用量的標記蛋白。實際上在大腸桿菌系統(tǒng)中含有UAA的治療性蛋白在1 000 L以上的高密度發(fā)酵情況下產(chǎn)量可以達到克每升級。例如含有對乙?；奖彼岬娜松L激素hGH在的定點PEG修飾產(chǎn)物已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)出了數(shù)千克的量［33］，修飾后的hGH在保持生物活性的前提下其血漿半衰期大大延長。

3 展望

當下對于遺傳密碼擴充技術(shù)的研究重點包括對探索新的正交aaRS/tRNA分子對、編碼更多的UAA、把正交系統(tǒng)應用于其他單細胞和多細胞生物體中等。編碼結(jié)構(gòu)更復雜的UAA需要不同的正交分子對、基于結(jié)構(gòu)的活性位點文庫以及更復雜的篩選方法，包括階梯式篩選氨酰tRNA合成酶［34］。接下來這項技術(shù)將被擴展應用于其他真核細胞如桿狀線和小鼠中。新的正交aaRS/tRNA分子對的發(fā)展還可應用于體內(nèi)合成含有非天然骨架的生物多聚體如β－多肽。

遺傳密碼擴充技術(shù)將進一步用于在體內(nèi)進化并篩選含有UAA的多肽、蛋白質(zhì)或整個有機體的研究。將UAA引入到治療性蛋白質(zhì)中，如雙特異性抗體，免疫毒素和疫苗將對醫(yī)藥發(fā)展產(chǎn)生重要影響。

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Application trends of expanding genetic codes in protein researches

LIU Ya－guang，F(xiàn)ANG Zheng－zhi，YAO Wen－bing
(School of Life and Technology，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Q51

A

1005－1678(2011)04－0328－04

2010－10－25

博士點基金(20090096110006)和“青藍工程”資助

劉亞光，男，碩士研究生;姚文兵，通信作者，教授，博士生導師，Tel:025－83271218，E－mail:wbyao@cpu.edu.cn。