李 毅，金 一，孫倫泉，汪 明

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193;2.University of Technology Sydney，Sydney，Australia)

病毒，特別是RNA病毒，侵入機(jī)體細(xì)胞后形成雙鏈RNA(dsRNA)，能夠被機(jī)體內(nèi)的各種dsRNA受體識(shí)別，并通過(guò)不同的信號(hào)途徑誘導(dǎo)機(jī)體和細(xì)胞產(chǎn)生I型干擾素、各種炎性因子和促炎因子，激活巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DCs)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)、自然殺傷細(xì)胞(NK)等多種免疫效應(yīng)細(xì)胞，使機(jī)體產(chǎn)生抗病毒和抗腫瘤的效果。聚肌胞(Poly I∶C)是一種人工合成的dsRNA，具有dsRNA的結(jié)構(gòu)特性，目前Poly I∶C作為天然dsRNA的擬似物被廣泛的用于各種研究，特別是抗病毒和抗腫瘤的研究中。本文將就dsRNA誘導(dǎo)機(jī)體非特異性免疫調(diào)節(jié)及利用Poly I∶C抗病毒的最新應(yīng)用做一綜述。

1 dsRNA刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異免疫的信號(hào)通路

細(xì)胞膜表面和胞漿中有多種識(shí)別受體能夠識(shí)別dsRNA，因此，dsRNA在細(xì)胞內(nèi)能夠通過(guò)不同細(xì)胞信號(hào)途徑激活機(jī)體的非特異性免疫。其中最重要的是TLR3和RNA解旋酶RIG-I/MDA5，這兩種dsRNA的受體在細(xì)胞內(nèi)有不同的定位、配體特異性和下游信號(hào)途徑。

1.1 TLR3 信號(hào)途徑

TLR3在機(jī)體內(nèi)分布廣泛，在各種細(xì)胞中均有表達(dá)。免疫細(xì)胞中能夠表達(dá)TLR3并誘發(fā)非特異性免疫的細(xì)胞有DCs、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和肥大細(xì)胞[1-3]。最近的研究表明，TLR3還在直接參與獲得性免疫反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞中表達(dá)[4-5]。在不同的細(xì)胞中，TLR3的定位各不相同。在包括樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的大部分細(xì)胞中，TLR3主要分布在細(xì)胞內(nèi)[6-7]。但在人成纖維細(xì)胞(如MRC-5細(xì)胞系)中，TLR3位于細(xì)胞表面，用抗TLR3的單抗將其封閉后，Poly I∶C不能刺激其產(chǎn)生INF-β。TLR3在不同細(xì)胞中的定位，可能與該細(xì)胞通過(guò)TLR3途徑產(chǎn)生IFNs而具有不同的抗病毒特性有關(guān)。

TLR3的結(jié)構(gòu)和其他TLRs一樣，屬于Ⅰ型跨膜受體蛋白，包括一個(gè)含有多個(gè)亮氨酸重復(fù)序列(LRRs)的胞外域，一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)含有TIR保守域的胞漿尾。TLR3的胞外域是與配體結(jié)合的部位，由23個(gè)串聯(lián)排列的LRRs組成，形成一個(gè)馬蹄形的螺旋結(jié)構(gòu)[8-9]。最近的研究表明，TLR3與dsRNA的結(jié)合位點(diǎn)是胞外域上無(wú)聚糖的LRR20。TLR3與dsRNA結(jié)合時(shí)，兩分子的TLR3聚合成雙體，并且其中的一個(gè)翻180°，分別與dsRNA的兩條鏈結(jié)合。胞外域的糖基化情況和配體的結(jié)構(gòu)特性都能夠影響TLR3結(jié)合dsRNA，如更長(zhǎng)的Poly I∶C雙鏈能夠更有力的促進(jìn)TLR3的下游信號(hào)，這可能是更長(zhǎng)的dsRNA能夠與多個(gè)TLR分子結(jié)合，介導(dǎo)TLR3的多聚化[10]。目前對(duì)于TLR3識(shí)別Poly I∶C并且將其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的機(jī)制尚不夠明確。最近Lee等[11]發(fā)現(xiàn)CD14與TLR3在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上的共定位，一旦Poly I∶C被內(nèi)化后，CD14能夠直接與Poly I∶C結(jié)合，并與TLR3共定位于內(nèi)涵體和溶酶體上，CD14將Poly I∶C傳遞給TLR3后啟動(dòng)下游信號(hào)途徑。

TIR域由5個(gè)α-螺旋包圍的5個(gè)β-折疊組成，這兩個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)由BB環(huán)(α-螺旋B連接β-鏈B)所連接，BB環(huán)能夠與TLR接頭分子相互作用。與其他TLRs的BB環(huán)都含有保守的脯氨酸殘基不同，TLR3上BB環(huán)的脯氨酸殘基被丙氨酸所取代，這使得TLR3成為唯一不需要MyD88輔助而直接能與TRIF結(jié)合的TLR[3]。當(dāng)TIR與細(xì)胞中TRIF結(jié)合后，通過(guò)不同的途徑間接活化多種轉(zhuǎn)錄因子如 NF-κB和 IRF3。TRIF是細(xì)胞中的TIR結(jié)合蛋白，在Poly I∶C通過(guò)TLR3途徑激活非特異性免疫過(guò)程中是必須的因子，Poly I∶C無(wú)法使TRIF敲除小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)。RIP1和TAK1在Poly I∶C激活NF-κB的途徑中具有重要的作用，缺少這兩者中的任何一個(gè)，都會(huì)阻斷Poly I∶C對(duì)NF-κB的活化。TRIF還能夠與TRAF3和NAP1結(jié)合，其中TRAF3的功能尚不明確，但是在TRAF3缺失的細(xì)胞中，TLR3不能刺激IFN-β的生成。NAP1是IKK相關(guān)激酶IKKε和TBK1(TANK結(jié)合蛋白，也稱為NF-κB活化蛋白NAK)的結(jié)合蛋白，并且也是IKKε/TBK1激酶復(fù)合物上的亞單位。IKKε/TBK1磷酸化IRF3，使其結(jié)合成二聚體并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[12]。

1.2 RIG-I/MDA5 信號(hào)途徑

從TLR3缺陷小鼠分離到的成纖維細(xì)胞和cDC細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞內(nèi)給以Poly I∶C，或是被仙臺(tái)病毒、新城疫病毒或VSV感染后同樣能夠產(chǎn)生INF-β，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)除了TLR3外，還有其他的受體能夠與外源性的Poly I∶C或者是病毒產(chǎn)生的dsRNA結(jié)合，并經(jīng)一系列的信號(hào)途徑傳導(dǎo)后激活NF-κB和IRF3。RIG-I/MDA5就是除TLR3外識(shí)別dsRNA最重要的受體之一。

RIG-I/MDA5位于細(xì)胞漿內(nèi)，屬于DExD/H box RNA解旋酶，含有兩個(gè)天冬酰胺富集域樣的結(jié)構(gòu)域(CARD-like結(jié)構(gòu)域)，這與RIG-I誘導(dǎo)的下游信號(hào)途徑有關(guān)，其中MDA5還含有一個(gè)單一的解旋酶結(jié)構(gòu)域[13]。

IPS-1是RIG-I/MDA5的下游受體分子，其一頭含有CARD結(jié)構(gòu)域，另一頭嵌在線粒體的雙層膜中。RIG-I/MDA5識(shí)別了外源性的Poly I∶C或者是病毒產(chǎn)生的dsRNA后形成起始信號(hào)，IPS-1上的CARD結(jié)構(gòu)域與RIG-I/MDA5結(jié)合后，活化TBK1/IKKi，磷酸化后的TBK1/IKKi能夠活化IRF3和IRF7，后者形成二聚體并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)[14]。

2 Poly I∶C對(duì)非特異性免疫的調(diào)節(jié)作用

2.1 促進(jìn)干擾素及其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生

當(dāng)NF-κB和IRF-3活化后，能夠引起細(xì)胞內(nèi)各種炎性因子和趨化因子的表達(dá)增加，其中最重要的是IFN-α/β，此外還有 TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10等。但是在不同的細(xì)胞內(nèi)，Poly I∶C刺激細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子有差別，且具有種屬特異性。體外實(shí)驗(yàn)表明，Poly I∶C能夠刺激人的非骨髓樣細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞和滑液囊成纖維細(xì)胞(RA-SFs)產(chǎn)生IL-6和TNF-α等炎性因子。但在正常的人DCs和巨噬細(xì)胞中，Poly I∶C不能夠通過(guò)TLR-3活化 NF-κB、IRF-3和 MARKs，因此不能使正常的這兩類細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6和IL-8，而Poly I∶C卻能夠刺激小鼠的DCs產(chǎn)生TNF-α和IL-6[15]。產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是由于不同的細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中含有不同的信號(hào)分子，或者是不同細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控分子不同，而且，每種細(xì)胞在免疫反應(yīng)中的作用也不一樣。

2.2 活化DCs和NK細(xì)胞

骨髓樹突狀細(xì)胞(mDC)是一種專業(yè)的抗原呈遞細(xì)胞，而且能夠與CD8+T細(xì)胞之間發(fā)生交叉呈遞作用，在機(jī)體抗病毒機(jī)制中具有重要作用。DCs細(xì)胞膜表面具有TRL3分子，Poly I∶C被mDC細(xì)胞膜上的TLR3識(shí)別后不但能夠產(chǎn)生I型干擾素，而且通過(guò)IFN-α/β所介導(dǎo)的信號(hào)途徑促進(jìn)DCs的成熟，提高了其作為專業(yè)抗原呈遞細(xì)胞呈遞抗原的能力，在抗病毒和抗腫瘤過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。Poly I∶C還能夠刺激 DCs上調(diào)表達(dá) HLA-DR、CD80、CD86、CD83，刺激 CTL和NK細(xì)胞的成熟。

NK細(xì)胞是機(jī)體抗病毒和抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，Poly I∶C與TLR3結(jié)合后，可以通過(guò)以下三條途徑激活NK細(xì)胞:①體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Poly I∶C與TLR3結(jié)合后，經(jīng)TICAM-1途徑活化 mDC細(xì)胞表面的分子如 IFN-γ、IL-12或 TNF-α等，通過(guò)mDC與NK細(xì)胞的直接接觸而活化NK細(xì)胞，這可能是mDC活化NK細(xì)胞的主要途徑，但是目前對(duì)這一途徑的體內(nèi)機(jī)理還不完全清楚;②mDC不與NK細(xì)胞直接接觸，而是通過(guò)向細(xì)胞外釋放I型IFN或其他細(xì)胞因子而激活周圍的NK細(xì)胞。這兩條途徑表明，TICAM-1是Poly I∶C誘導(dǎo)NK細(xì)胞殺傷腫瘤的重要因子[16]。③Poly I∶C不通過(guò)TLR3-TICAM-1途徑，而是可能通過(guò)啟動(dòng)細(xì)胞質(zhì)中的dsRNA受體MDA5，啟動(dòng)RIG-I/MDA5信號(hào)途徑轉(zhuǎn)錄I型IFN而激活NK細(xì)胞。因?yàn)樵赥ICAM-1-/-小鼠接受Poly I∶C刺激后，仍然可以觀察到NK細(xì)胞被激活。

2.3 促進(jìn)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是機(jī)體抵抗微生物感染和腫瘤擴(kuò)散的一種重要的自我保護(hù)機(jī)制。最近的研究發(fā)現(xiàn)，dsRNA能夠通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，如在胰腺β細(xì)胞中誘導(dǎo)PKR和caspase信號(hào)途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而在上皮細(xì)胞中則主要是通過(guò)誘導(dǎo)caspase信號(hào)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17-19]。Poly I∶C能夠通過(guò)與TLR3結(jié)合后，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生I型干擾素，活化NF-κB p65和caspase導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，TLR-3的下游信號(hào)分子IL-1受體相關(guān)激酶-4(IRAK-4)和IFN-β可能在其中具有重要作用[20-21]，但是其具體的機(jī)理尚不明確。

3 Poly I∶C的衍生物及其抗病毒應(yīng)用

Poly I∶C具有雙鏈RNA的結(jié)構(gòu)，能夠模擬病毒感染后所形成的dsRNA，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗病毒免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，具有良好的抗病毒作用，是一種廣譜的抗病毒劑，在體內(nèi)對(duì)黃熱病毒、西方馬腦炎病毒、日本腦炎病毒、裂谷熱病毒和狂犬病毒都有抑制作用。但是將Poly I∶C直接作為藥物應(yīng)用于臨床時(shí)，會(huì)對(duì)身體產(chǎn)生一定的毒性，如導(dǎo)致發(fā)熱，血凝異常，肝臟酶的輕微增高等，且和給藥量成正比。為了降低其對(duì)機(jī)體的毒性，并提高Poly I∶C刺激機(jī)體產(chǎn)生干擾素的能力，人們對(duì)其進(jìn)行了改造，創(chuàng)造出了多種Poly I∶C的衍生物。

將Poly I∶C與聚左旋賴氨酸混合后溶于羧甲基纖維素形成的復(fù)合物(PolyICLC)便是其中之一。PolyICLC在小鼠體內(nèi)誘發(fā)的IFN最高濃度比Poly I∶C高5～8倍[22]。Wong等[23]的研究表明，PolyICLC在小鼠體內(nèi)具有抗流感病毒(H1N1)的作用，且對(duì)接受致死劑量病毒感染的小鼠具有100%的保護(hù)率。但是，PolyICLC同樣會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的毒性，如使動(dòng)物的體重降低，體溫降低，造成肺動(dòng)脈栓塞和肝壞死，導(dǎo)致血清中的鳥苷酸羰基轉(zhuǎn)移酶、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平升高。使用脂質(zhì)體包被PolyICLC后，形成的Liposome-PolyICLC能夠顯著的降低PolyICLC的副作用[24]，其抗流感病毒保護(hù)期能夠從12 d提高到21 d，且對(duì)高致病性禽流感病毒(H5N1)也有抑制活性[25]。Lau等[26]利用 PIKA(一種脂質(zhì)體包被的PolyICLC)作為預(yù)防和治療藥物，能夠有效抑制A型流感病毒在小鼠體內(nèi)的增殖，且能提高滅活流感疫苗的免疫保護(hù)，這種作用與PIKA能夠通過(guò)TLR3途徑激活機(jī)體的先天免疫有關(guān)。

PolyIC∶MPC 和 PolyIC∶PolyC12U 是 Poly I∶C 的另兩種衍生物。Poly IC∶MPC是將Poly I∶C胞嘧啶堿基上的5'巰基化后形成部分巰基化雙鏈RNA[27]。研究表明，7.5%巰基化是刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-α/β、IFN-γ，活化巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，并具有最佳抗病毒和抗腫瘤效果的最佳比例[28]。PolyIC∶MPC對(duì)小鼠，兔以及豚鼠的毒性很小，且比Poly I∶C更能耐受血清中核糖核酸酶的降解[29]。

美國(guó)Hemispherx生物制藥公司發(fā)明的Ampligen(PolyI∶PolyC12U)是一種錯(cuò)配的雙鏈RNA，能夠上調(diào)或下調(diào)2，5-腺苷酸合成酶/RNaseL(2-5A synthetase/RNase L)系統(tǒng)和P68蛋白激酶系統(tǒng)，且這種作用不依賴于干擾素。RNase-L通路是參與病毒感染免疫反應(yīng)的一個(gè)系統(tǒng)，稱為細(xì)胞內(nèi)免疫。PolyI∶PolyC12U激活2-5A合成酶，活化的2-5A合成酶再激活RNase-L，而RNase-L可以破壞病毒RNA。2-5A合成酶還能夠抑制反轉(zhuǎn)錄酶，因此PolyI∶PolyC12U可以被用來(lái)抑制HIV和HBV的增殖。PolyI∶PolyC12U可以誘導(dǎo)p68激酶的自身磷酸化，通過(guò)另外兩個(gè)因子elF2a和elf25-P抑制病毒蛋白合成。Ampligen對(duì)肝炎病毒有良好的抑制效果，并已獲得FDA授予的罕用藥資格，在治療慢性疲勞綜合征和艾滋病方面已分別進(jìn)入Ⅲ期和Ⅱ期臨床研究[30]。

4 結(jié)語(yǔ)

先天免疫在抗病毒過(guò)程中具有重要的作用。Poly I∶C作為先天免疫的刺激劑，激發(fā)抗病毒因子作用迅速，且能夠避免化學(xué)藥物和疫苗由于病毒變異而產(chǎn)生的耐藥性，對(duì)于抗病毒治療具有一定的優(yōu)勢(shì)，目前在臨床上可用于慢性乙型肝炎、流行性出血熱、流行性乙型腦炎、病毒性角膜炎、帶狀皰疹、各種疣類和呼吸道感染等。但由于對(duì)機(jī)體存在一定毒副作用，因此還需要進(jìn)行改進(jìn):一是進(jìn)一步對(duì)dsRNA雙鏈分子的改造或修飾，使之更加容易被細(xì)胞上的受體識(shí)別，發(fā)揮更大的免疫刺激作用，降低對(duì)機(jī)體的毒副作用;二是由于合成技術(shù)的限制，這類藥物的合成以及脂質(zhì)體包被的成本較高，價(jià)格比較昂貴，因此需要研究更加經(jīng)濟(jì)的合成工藝和劑型設(shè)計(jì)，提高緩釋效果，降低其毒副作用，增加其臨床應(yīng)用價(jià)值。

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